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        超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)輔助降血脂保健食品中6 種非法添加化學(xué)藥物

        2018-10-08 02:50:38李曉蕾楊朝芬
        食品科學(xué) 2018年18期
        關(guān)鍵詞:洛伐他汀降血脂保健食品

        李曉蕾,陳 軍,楊朝芬,楊 俊

        (1.昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心,云南 昆明 650000;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所,云南 昆明 650000)

        近年,隨著生活質(zhì)量的顯著提高,人們對(duì)自身健康越來(lái)越關(guān)注,保健品市場(chǎng)利益空間迅速增加。但是,隨之而來(lái)的食品藥品安全問題不斷增多,一些不法分子為獲取高額利益在保健食品中非法添加化學(xué)藥物[1-2],使其功效顯著。此類非法添加隨意性大,劑量不明確,標(biāo)簽上又未作說明,往往會(huì)導(dǎo)致消費(fèi)者長(zhǎng)期、超量服用而引起毒性反應(yīng),嚴(yán)重的甚至危及生命[3]。

        目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)于保健食品中非法添加化學(xué)藥的研究很多[4-9],但降血脂類化學(xué)藥物添加方面的研究尚不夠深入。而近年發(fā)病率逐漸上升的高血脂癥等心腦血管疾病,已成為嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的“隱形殺手”[10-11],輔助降血脂保健食品市場(chǎng)也呈飛速上升趨勢(shì)。已有報(bào)道的檢測(cè)方法有薄層色譜法[12]和高效液相色譜法[13-14],但存在選擇性差、定性能力弱和靈敏度低的問題;也有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16],但檢測(cè)成分較少、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局曾于2010年和2017年先后頒布了《輔助降血脂類保健食品違法添加藥物的檢測(cè)方法》[17]、《保健食品中75 種非法添加化學(xué)藥物的檢測(cè)》[18]、《食品中西布曲明等化合物的測(cè)定》[19],方法中均含有降血脂類化學(xué)藥成分的檢測(cè),但檢測(cè)成分較少而檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng),靈敏度也不夠高。因此研究降血脂類化學(xué)藥物的檢測(cè)方法,對(duì)促進(jìn)質(zhì)量監(jiān)督,保障食品安全和人民健康是十分有必要的。

        本實(shí)驗(yàn)擬選取6 種臨床上較常用,相對(duì)生產(chǎn)成本較低因而價(jià)格較低,易于非法添加的降血脂化學(xué)藥物,采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法,以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multi-reaction monitoring,MRM),建立快速、有效地定性、定量檢測(cè)輔助降血脂保健食品中6 種非法添加降血脂藥物成分的分析方法,并對(duì)20 批市售的輔助降血脂功能保健食品進(jìn)行檢測(cè),擬為降血脂類保健食品安全監(jiān)控提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        輔助降血脂功能保健食品 市售。

        對(duì)照品:煙酸(批號(hào)LF80N66,純度99.5%)、普伐他汀鈉(批號(hào)8-XJZ-27-1,純度98.0%)、氟伐他汀鈉(批號(hào)7-ABY-122-1,純度98.0%)、美伐他?。ㄅ?hào)2-NYL-167-1,純度98.0%)、洛伐他?。ㄅ?hào)LK10O58,純度98.0%)、辛伐他?。ㄅ?hào)11-SCC-167-1,純度98.0%) 中國(guó)食品藥品檢定研究院;實(shí)驗(yàn)用水為超純水;樣品處理所用甲醇為分析純,其他試劑均為質(zhì)譜純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        ACQUITY UPLC Xevo TQD液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源、Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)) 美國(guó)Waters公司;Advantage-10/Elix Milli-Q超純水儀 美國(guó)Millopore公司;BP211D型電子天平德國(guó)Sartorius科學(xué)儀器有限公司;KQ-300DA型數(shù)控型超聲波提取儀 上海波龍電子有限公司。

        1.3 方法

        1.3.1 色譜條件

        色譜柱:Waters Acquity BEH-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液,流動(dòng)相B為乙腈;梯度洗脫:0~2.5 min,50% B,2.5~3.0 min,60% B,3.0~3.5 min,100% B,3.5~4.0 min,50% B;流速0.2 mL/min;色譜柱溫度30 ℃;進(jìn)樣量1 μL[20-22]。

        1.3.2 質(zhì)譜條件

        電噴霧離子源正離子模式掃描;毛細(xì)管電壓2.68 kV;脫溶劑氣溫度500 ℃;脫溶劑氣流量850 L/h;錐孔氣流速50 L/h;碰撞氣體為氬氣;子離子掃描及MRM模式同時(shí)監(jiān)測(cè)[23-24]。經(jīng)質(zhì)譜條件優(yōu)化后,各物質(zhì)的色譜保留時(shí)間、分子離子與特征碎片離子及其采集參數(shù)[25]見表1。

        表1 6 種降血脂化學(xué)藥物的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectroscopic parameters for six antilipemic chemicals

        1.3.3 溶液的制備

        對(duì)照品溶液:分別精密稱取煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀適量(約1~5 mg),置于10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,定容,搖勻,作為各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。各取單標(biāo)儲(chǔ)備液適量(0.1~1 mL),置于50 mL容量瓶,用甲醇稀釋并定容配制成混合對(duì)照品溶液,使用時(shí)進(jìn)一步稀釋。

        供試品溶液:將具有輔助降血脂功效的保健食品每個(gè)品種取10~20 粒油狀樣品內(nèi)容物,混勻;或取10~20 片(丸或袋)固體樣品,置研缽中研磨均勻呈粉末狀。分別精密稱取一次推薦服用量的樣品,置于50 mL容量瓶中,加甲醇40 mL,超聲提取15 min。冷卻至室溫后,用甲醇稀釋定容,搖勻,直接作為供試品溶液,分析時(shí)上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后上樣。

        陰性樣品溶液:取具有代表性的固體顆粒劑(和信茶)、膠囊劑(油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊)和片劑(阿膠含片)3 種劑型共4 種陰性樣品,分別精密稱取一次推薦服用量樣品置于50 mL容量瓶,與供試品溶液同法制成陰性樣品溶液。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 6 種化學(xué)藥物的色譜及質(zhì)譜特性

        色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化:實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相的組成(甲醇-水、甲醇-甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-甲酸溶液)、流速(0.1、0.2、0.4 mL/min)和柱溫(20、30、40 ℃)等條件分別進(jìn)行考察。對(duì)流動(dòng)相的考察發(fā)現(xiàn),甲醇-水體系較乙腈-水體系分析時(shí)間長(zhǎng),峰形差,因此選用乙腈-水體系,而乙腈-水體系在水中添加0.1%的甲酸后峰形更好,因此選用0.1%甲酸-乙腈溶液做流動(dòng)相。在流速為0.4 mL/min或溫度為40 ℃時(shí),由于煙酸、普伐他汀鈉和洛伐他汀、辛伐他汀2 組成分的保留時(shí)間比較接近,不能很好地達(dá)到基線分離,而流速低(0.1 mL/min)或溫度低(20 ℃)均會(huì)導(dǎo)致分析時(shí)間延長(zhǎng),故最終確定0.2 mL/min,柱溫30 ℃為實(shí)驗(yàn)最佳條件。優(yōu)化得到的最佳色譜條件可在4 min內(nèi)高分離度、快速有效地分離6 種化學(xué)藥物,均優(yōu)于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的檢測(cè)方法[17-19]及相關(guān)文獻(xiàn)[21-24]方法。質(zhì)譜部分在正離子、MRM模式下,用1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液手動(dòng)調(diào)諧結(jié)合自動(dòng)調(diào)諧,逐一選擇并確定適合各化合物的準(zhǔn)離子峰及母離子,采用子離子掃描方式進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析,對(duì)子離子進(jìn)行優(yōu)化選擇,找出滿足化合物碎裂規(guī)律的子離子,確定定量與定性離子,同時(shí)優(yōu)化毛細(xì)管電壓和錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù),使離子強(qiáng)度最大、分離度最佳。最后確定測(cè)定6 種化學(xué)藥物的定性和定量離子對(duì),共12 個(gè)離子檢測(cè)通道。各化合物采集的總離子流見圖1,定量離子對(duì)的MRM離子流見圖2。

        圖1 6 種降血脂類化學(xué)藥物的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of six antilipemic drugs

        圖2 6 種降血脂化學(xué)藥對(duì)照品定量離子對(duì)的MRM色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of quantitative ions of 6 antilipemic drug standards

        2.2 基質(zhì)效應(yīng)考察結(jié)果

        本實(shí)驗(yàn)選取具有代表性的4 種陰性樣品基質(zhì):固體顆粒劑(和信茶)、膠囊劑(油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊)和片劑(阿膠含片)進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察?;|(zhì)效應(yīng)根據(jù)基質(zhì)空白配制標(biāo)樣響應(yīng)值與同質(zhì)量濃度溶劑標(biāo)樣響應(yīng)值的比值進(jìn)行評(píng)價(jià)[26-27],大于1時(shí)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),小于1時(shí)為基質(zhì)抑制效應(yīng)。對(duì)于基質(zhì)效應(yīng)過強(qiáng)的樣品,應(yīng)采取相應(yīng)的處理手段以減小其對(duì)測(cè)定的干擾。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,基質(zhì)對(duì)煙酸、普伐他汀鈉表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),而對(duì)氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀表現(xiàn)出基質(zhì)抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)考察的基質(zhì)效應(yīng)在0.82~1.18之間,表明樣品基質(zhì)對(duì)目標(biāo)成分響應(yīng)干擾相對(duì)較小。

        樣品處理過程中,大部分基質(zhì)較簡(jiǎn)單,前處理時(shí)采用甲醇超聲提取過濾后即上樣分析。但個(gè)別樣品(如苦瓜洋參軟膠囊和蒼芎膠囊)基質(zhì)相對(duì)比較復(fù)雜,對(duì)出峰時(shí)間較早的煙酸和普伐他汀鈉基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)大于1.3,影響數(shù)據(jù)正確性,且易污染質(zhì)譜檢測(cè)器離子源,故先將樣品過WAX固相萃取柱凈化處理后再上機(jī)分析[28]??喙涎髤④浤z囊和蒼芎膠囊凈化后基質(zhì)效應(yīng)降至1.12和1.15,但凈化后回收率降低至70.2%和65.4%,因此在基質(zhì)影響相對(duì)較小的情況下并未對(duì)所有樣品進(jìn)行凈化處理。

        2.3 方法專屬性考察結(jié)果

        取具有代表性的固體顆粒劑(和信茶)、膠囊劑(油狀大豆磷脂膠囊、粉狀三七膠囊)和片劑(阿膠含片)3 種劑型共4 種陰性樣品,按陰性樣品溶液的制備方法處理后,依1.3.1節(jié)方法進(jìn)樣,按1.3.2節(jié)方法采集圖譜,得到陰性樣品的MRM離子流色譜圖,12 個(gè)離子通道中均未見有干擾6 種目標(biāo)物的色譜峰。結(jié)果表明,具有代表性的4 種陰性樣品對(duì)所測(cè)6 種目標(biāo)物均無(wú)干擾,方法專屬性良好。

        2.4 線性關(guān)系考察與檢出限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantity,LOQ)測(cè)定結(jié)果

        取混合對(duì)照品溶液,按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法進(jìn)樣測(cè)定,以各組分定量離子對(duì)的峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R2),見表2。結(jié)果表明,6 種化學(xué)藥物的線性關(guān)系在線性范圍內(nèi)良好,R2均在0.995 5以上。取陰性樣品和信茶適量,置于50 mL容量瓶中,按1.0 mg/g的添加量加入混合對(duì)照品溶液,按供試品溶液同法經(jīng)逐步稀釋后進(jìn)樣,以3 倍信噪比時(shí)計(jì)算各化學(xué)藥的LOD,為10 倍信噪比時(shí)計(jì)算各化學(xué)藥的LOQ,其中洛伐他汀、美伐他汀和辛伐他汀的LOD降低至國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布檢測(cè)方法[18]的12.5%以下。結(jié)果表明方法LOD均在4~39 μg/kg之間,說明方法具有較高的靈敏度。

        表2 6 種降血脂化學(xué)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率及LOD、LOQTable 2 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges,LODs, and LOQs for six antilipemic drugs

        2.5 進(jìn)樣精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        取混合對(duì)照品溶液1 μL,按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定,連續(xù)測(cè)定6 次,計(jì)算煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀定量離子對(duì)質(zhì)譜峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)分別為1.16%、5.20%、2.26%、3.88%、2.12%、6.86%,均在7%以內(nèi),表明方法的精密度良好。

        2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        精密稱取三七膠囊陰性樣品6 份,每份為1 次日常服用量,分別精密加入對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,使含各種化學(xué)藥含量均為1.0 mg/kg,按1.3.3節(jié)方法制成供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算各成分含量及其RSD。結(jié)果煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他汀的含量分別為0.97、0.99、1.02、1.01、0.95、0.96 mg/kg;RSD分別為2.46%、2.49%、3.14%、1.86%、1.50%、1.57%,表明該方法重復(fù)性較好。

        2.7 溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        取供試品溶液1 份,在配制后避光冷藏放置0、2、4、6、8、12 h。根據(jù)6 種化學(xué)藥的定量離子對(duì)峰面積計(jì)算其RSD分別為2.83%、1.75%、4.29%、2.58%、5.61%、1.87%,表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

        2.8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        表3 3 種不同基質(zhì)陰性樣品中6 種降血脂化學(xué)藥的加標(biāo)回收率結(jié)果Table 3 Recoveries of six antilipemic drugs in three different spiked matrixes

        續(xù)表3

        精密稱取陰性樣品和信茶、三七膠囊、阿膠含片各9 份,每份為1 次日常服用量,分為3 組,按1.3.3節(jié)方法制備成陰性樣品溶液,分別進(jìn)行定量限1、2、10 倍(0.1、0.2、1.0 mg/kg)3 個(gè)添加水平的回收率實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3。6 種化學(xué)藥物的加樣平均回收率均在80.2%~106.1%之間。

        2.9 樣品測(cè)定

        本實(shí)驗(yàn)共收集輔助降血脂類功能性保健食品20 批,取各樣品按1.3.3節(jié)方法制備供試品溶液,按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)樣測(cè)定,根據(jù)定量監(jiān)測(cè)離子對(duì)的色譜峰面積,采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中各化學(xué)藥物成分的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),20 批輔助降血脂類保健食品中共檢出3 批可能添加化學(xué)藥物,分別檢測(cè)出煙酸和洛伐他汀,含量分別為煙酸81.2、72.7 μg/g,洛伐他汀690 μg/g。

        3 結(jié) 論

        本實(shí)驗(yàn)建立輔助降血脂類保健食品中6 種非法添加降血脂化學(xué)藥物(煙酸、普伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、美伐他汀、洛伐他汀、辛伐他?。┑某咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法,具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可為藥品監(jiān)管及規(guī)范保健品市場(chǎng)提供理論依據(jù)。對(duì)于如何杜絕保健食品非法添加的情況,建議一方面大力發(fā)展更先進(jìn)靈敏的檢測(cè)技術(shù),另一方面也需建立和完善非法添加有害化學(xué)成分的各種譜庫(kù)信息,以利于對(duì)有害物進(jìn)行篩查[29-30],此外,從多方面加強(qiáng)監(jiān)管以及增加懲罰力度也十分重要。

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