徐瀟穎，劉 柱，梁晶晶，陳萬勤，周 霞，羅金文*

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江 杭州 310052）

水體出現(xiàn)富營養(yǎng)化現(xiàn)象時，藻類會大量繁殖，不僅可使水生生物死亡，其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物（如藻毒素），也會通過飲用水和水產(chǎn)品危害人類健康[1-4]。在水華藻類中，毒性最強(qiáng)、范圍最廣的是藍(lán)藻，其廣泛分布于江河、湖沼、海洋等水體中，在代謝過程中產(chǎn)生各種毒素，其中微囊藻毒素（microcystins，MCs）是危害最為嚴(yán)重的一類，具有強(qiáng)烈致癌作用[5-8]。MCs是一類有單環(huán)七肽的天然毒素，其主要結(jié)構(gòu)為環(huán)D-丙氨酸-R1-R2-赤-β-甲基-D-異天冬氨酸-L-Z-adda-D-異谷氨酸-N-甲基脫氫丙氨酸，通過兩個可變的L-氨基酸（R1和R2）的更替及其構(gòu)成氨基酸的去甲基化從而衍生出眾多的毒素類型，至今為止，發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)體已超過了100 種[9-13]。肝毒性是MCs的主要毒性，MCs進(jìn)入體內(nèi)后，專一性地與肝細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸酶結(jié)合，當(dāng)攝入的藻類毒素濃度低時，具有潛在的肝毒性和癌誘發(fā)活性，當(dāng)攝入濃度高時，則會引起急性中毒，嚴(yán)重者導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹、壞死、甚至死亡。MCs構(gòu)型中所含有的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和間隔雙鍵，使其能穩(wěn)定存在于水體及藍(lán)藻中。若水體受到MCs的污染，一方面會對飲用受到污染水的人群造成威脅；另一方面，MCs會在以浮游植物為食的淡水水產(chǎn)品（魚、蝦以及貝類等）體內(nèi)進(jìn)行富集[14-17]，食用受到污染的水產(chǎn)品亦對人類健康存在潛在威脅[18]。

近年來，水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致的藻類毒素安全問題日益受到重視，所以飲用水中MCs的測定方法也日趨多樣化，除了傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法、蛋白磷酸酶抑制等生化分析法，還有液相色譜法[18-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[21-23]以及高分辨色譜分析法[24]等色譜分析方法。而水產(chǎn)品相比飲用水基質(zhì)更復(fù)雜，所以需采用適當(dāng)?shù)那疤幚斫档突|(zhì)對分析過程中的干擾，不少學(xué)者[25-26]采用HLB進(jìn)行凈化，但凈化過程耗時較長且成本較高；也有采用加速溶劑萃取法[27]，對水產(chǎn)品中的藻類毒素進(jìn)行提取。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，活性炭可以吸附藻類毒素，由于需要大量活性炭才能達(dá)到有效的吸附，而過量活性炭的使用對環(huán)境會造成不可避免的污染[28-29]。因此，本研究創(chuàng)新使用了碳納米管作為吸附劑，利用其化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、成本低等優(yōu)點(diǎn)，對水產(chǎn)品中的MCs進(jìn)行富集，再結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定量分析。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件以達(dá)到較好的回收率，建立水產(chǎn)品中痕量MCs的高選擇性和高靈敏度的精確分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱸魚、鰱魚、鳙魚、河蚌、河蝦等實(shí)驗(yàn)所用水產(chǎn)品購買于浙江杭州當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場。

多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）（純度＞97%，直徑20～40 nm，長度＞5 μm）深圳市納米港科技有限公司；磁性多壁碳納米管（magnetic multi-walled carbon nanotubes，mMWCNTs）制備過程為利用濃硝酸羧化后磁化[30]；羧基化碳納米管（carbon nanotubes-COOH，CNTs-COOH）、氨基化碳納米管（carbon nanotubes-NH2，CNTs-NH2） 中科時代納米中心；Oasis HLB固相萃取小柱（200 mg/6 mL）美國Waters公司。

MCs標(biāo)準(zhǔn)品MC-YR（CAS：101064-48-6，（10±0.54）μg/mL）、MC-RR（CAS：111755-37-4，（10±0.50）μg/mL）、MC-LR（CAS：101043-37-2，（10±0.52）μg/mL） 香港Bepure公司；甲醇、乙腈（均為色譜級） 德國Merck公司；甲酸銨、乙酸銨（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸（質(zhì)譜級） 美國Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XR 30A液相色譜儀 日本Shimadzu公司；三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配有電噴霧離子源） 美國AB SCIEX公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；氮?dú)獯蹈蓛x 瑞典Biotage公司；渦旋混合器 上海琪特公司；酸度計 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters Cortecs C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；流動相：流動相為甲醇（A）和5 mmol/L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫程序：0～2 min，25% A；2～4 min，25%～80% A；4～6 min，80% A；6～9 min，80%～25% A。流速0.35 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，多重反應(yīng)監(jiān)測正離子掃描，電離電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，氣簾氣流速30 L/min，碰撞氣流量50 L/min，化合物定性離子對、定量離子對、去簇電壓、碰撞能量見表1。

表1 多重反應(yīng)監(jiān)測模式下MCs的質(zhì)譜條件Table 1 MS parameters for the analysis of microcystins under MRM mode

1.3.3 前處理

1.3.3.1 提取

準(zhǔn)確稱取2 g淡水產(chǎn)品的食用部分于50 mL離心管中，加入8 mL 80%甲醇溶液，均質(zhì)器上以8 000 r/min混合1 min，然后超聲提取5 min，以15 000 r/min離心5 min后，取上清液，重復(fù)提取1 次，合并上清液于20 mL容量瓶中，用80%甲醇溶液定容至刻度。

1.3.3.2 固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）法凈化

準(zhǔn)確移取4.0 mL定容后的上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，用水稀釋至40 mL，待SPE凈化。HLB固相萃取小柱在使用前依次用甲醇和水各5 mL以1～2 mL/min流速淋洗活化后，將40 mL稀釋液轉(zhuǎn)移至HLB小柱上，控制流速1～2 mL/min；用5 mL 10%甲醇溶液溶液淋洗抽干后，用5 mL 0.1%甲酸-甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，于35 ℃氮吹至近干，最后用20%甲醇溶液定容至2.0 mL，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜儀測定。

1.3.3.3 分散固相萃?。╠ispersive solid phase extraction，DSPE）法凈化

取上述提取液2.0 mL于50 mL離心管中用水稀釋至20 mL后，加入40 mg碳納米管后，渦旋振蕩10 min，使含有MCs的樣品與吸附劑充分接觸混合后，5 000 r/min離心5 min（mMWCNTs可采用磁鐵置于樣品底部吸附），使吸附劑聚集于離心管底部，除去上清液。隨后加入體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈洗脫液1.0 mL，超聲混合10 min，5 000 r/min離心5 min后，過0.22 μm濾膜，進(jìn)行高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSPE的條件優(yōu)化結(jié)果

在室溫條件下，向含有3 種MCs的空白鱸魚基質(zhì)溶液中分別加入CNTs-COOH、CNTs-NH2、MWCNTs以及自制mMWCNTs，對萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。以3 種MCs的回收率為衡量指標(biāo)選擇最優(yōu)的萃取條件，對實(shí)驗(yàn)過程中涉及的吸附劑用量、洗脫溶劑以及溶液pH值進(jìn)行考察。

2.1.1 碳納米管種類對回收率的影響

以不含目標(biāo)物的鱸魚為空白基質(zhì)，分別采用4 種碳納米管作為分散固相萃取吸附劑，對10 μg/kg加標(biāo)水平下3 種MCs的回收率進(jìn)行考察，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，CNTs-COOH以及mMWCNTs對3 種MCs都有較好的吸附效果，回收率在90.2%～96.2%之間，而CNTs-NH2以及MWCNTs的回收率遠(yuǎn)低于前兩者。主要是由于CNTs-COOH、mMWCNTs在基團(tuán)功能化中都帶有羧基，而羧基在凈化過程中的酸性（洗脫）條件下帶正電荷，對帶有兩個可變氨基酸的MCs可以有效的吸附，而CNTs-NH2、MWCNTs在酸性條件下對MCs都存在部分吸附作用，致使回收率偏低，因此考慮mMWCNTs作為DSPE的吸附劑。

圖1 不同碳納米管對3 種MCs回收率的影響Fig. 1 Recoveries of 3 MCs by using different CNTs

2.1.2 mMWCNTs添加量對回收率的影響

分別稱取5、10、20、50、100 mg mMWCNTs吸附劑，加入20 mL含有3 種MCs（質(zhì)量濃度均為10 μg/L）的混合對照品基質(zhì)溶液中，使mMWCNTs與含目標(biāo)物的溶液充分混合后，在相同的條件下進(jìn)行洗脫，比較不同質(zhì)量吸附劑對MCs的回收率，結(jié)果見圖2。在5～20 mg范圍內(nèi)，隨吸附劑添加量的增大，3 種MCs的回收率都呈增加趨勢，20～50 mg時增加趨勢變緩慢，大于50 mg后，目標(biāo)物的回收率不再隨吸附劑的增加而增大。因此，選擇40 mg作為mMWCNTs的添加量。

圖2 mMWCNTs添加量對MCs吸附的影響Fig. 2 Effect of mMWCNTs addition on microcystins adsorption

2.1.3 不同洗脫劑對回收率的影響

圖3 不同洗脫劑對MCs洗脫的影響Fig. 3 Effects of different eluents on microcystins recovery

分別對甲醇、乙腈、0.1%甲酸-甲醇溶液、0.1%甲酸-乙腈溶液4 種洗脫劑的洗脫效果進(jìn)行考察，由圖3可知，乙腈較甲醇的洗脫效果更優(yōu)，在洗脫溶劑中加入0.1%甲酸與不加甲酸進(jìn)行比較時，發(fā)現(xiàn)相同溶劑中，加入甲酸的洗脫回收率較高，其中采用0.1%甲酸-乙腈溶液洗脫mMWCNTs吸附的MCs回收率在92.3%～95.5%之間，主要是由于MCs分子存在兩個自由的、可離子化的羧基和一個自由的氨基，這決定了生物分子MC-LR、MC-YR、MC-RR的帶電情況。因此酸性洗脫液促進(jìn)了多肽羧酸基團(tuán)的質(zhì)子化，使目標(biāo)物更容易被洗脫，所以選擇0.1%甲酸-乙腈溶液為最終洗脫劑。

2.2 不同凈化方式下MCs的方法學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液使用鱸魚空白基質(zhì)制備溶液進(jìn)行逐級稀釋，得到1～50 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的峰面積Y為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，各化合物的線性范圍如表2所示，在1～50 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。

采用外標(biāo)法定量，在鱸魚的空白基質(zhì)中添加不同濃度的待測物，應(yīng)用1.3.3節(jié)的前處理方法，以信噪比為3確定各目標(biāo)化合物在不同方法中的檢出限，信噪比為10確定各目標(biāo)化合物的定量限，結(jié)果見表2。3 種MCs在不同凈化方式得到檢出限分別為0.1、0.2 μg/kg，可以達(dá)到對水產(chǎn)品中痕量藻毒素檢測的靈敏度。

表2 不同凈化方式下3 種MCs的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and detection limits for 3 MCs

表3 不同凈化方式下MCs的回收率與RSD（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of microcystins from spiked fish sample using different clean-up methods (n= 6)

以未檢出3 種藻類毒素的鱸魚為空白樣品進(jìn)行3 個不同含量（0.5、2、10 μg/kg）的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，按1.3.3節(jié)中所述前處理方法，每個含量設(shè)定6 個平行，分別對2 種不同的凈化方式進(jìn)行考察，結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，采用HLB獲得的回收率為90.8%～96.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.2%～3.0%，相比于DSPE，該方法更為穩(wěn)定，且回收率較高，但成本較高、凈化步驟繁瑣、操作過程費(fèi)時。DSPE回收率為88.7%～95.5%，略低于SPE法，但可以有效地將采用SPE法時每個樣品成本降低至10%以內(nèi)，并將縮短凈化時間至原來的1/2。

2.3 不同基質(zhì)中MCs的回收率與精密度

采用不同的凈化方式在不同基質(zhì)的空白水產(chǎn)品中進(jìn)行2 μg/kg的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，采用不同凈化方法時，HLB固相萃取柱獲得的回收率在89.6%～96.3%之間，且RSD均不大于2.8%，而采用DSPE獲得的回收率較低，RSD大。在不同基質(zhì)中，以魚為基質(zhì)獲得的加標(biāo)回收率要略高于另2 種基質(zhì)，主要是由于貝類和蝦中的蛋白含量較高，含水量較低，當(dāng)加入80%甲醇溶液進(jìn)行提取時，基質(zhì)中蛋白變性，進(jìn)而導(dǎo)致提取回收率下降。

表4 不同基質(zhì)中MCs的回收率與RSD（n=6）Table 4 Recoveries and RSDs of microcystins in different matrixes spiked at 2 μg/kg (n= 6)

2.4 實(shí)際樣品的測定結(jié)果

在2017年7月浙江省杭州地區(qū)附近水域采集60 個水產(chǎn)樣品，包括鰱魚、鳙魚、河蚌、河蝦等常見的水產(chǎn)品。去除不可食用部分，勻漿后進(jìn)行測定。結(jié)果表明，確有少數(shù)水產(chǎn)品中存在藻毒素，其中MC-LR檢出量在0.28～0.77 μg/kg之間，檢出率為10%，而MC-RR的檢出值為0.32～0.58 μg/kg，檢出率為6.7%，MC-YR未見檢出，有檢出的樣品主要為魚類和河蝦。對有檢出樣品進(jìn)行兩種凈化方式比較，結(jié)果差異不顯著，說明DSPE凈化也可對水產(chǎn)品中的MCs進(jìn)行測定。

3 結(jié) 論

對4 種不同性質(zhì)的碳納米吸附劑進(jìn)行考察，并通過單一變量法對碳納米吸附劑的添加量以及不同洗脫溶劑的考察，最終確立了以40 mg的mMWCNTs為分散固相萃取吸附劑對含有MCs的提取溶液進(jìn)行吸附后，利用0.1%甲酸-乙腈溶液進(jìn)行洗脫，能獲得較好的回收，回收率在88.7%～95.5%之間，RSD均小于4.2%，而HLB回收率為89.6%～96.7%，但其節(jié)約時間以及耗材成本低，檢出限能夠滿足我國標(biāo)準(zhǔn)控制要求，且在對不同基質(zhì)的回收率及精密度考察中，具有較好的適用性，回收率水平均在88.1%以上，為水產(chǎn)品中MCs的測定提供了新方法。