孫 瑩，潘思安，李萌萌，鄧威威，張正竹*

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230036）

咖啡堿是茶葉中含量最高的生物堿，也是茶葉重要的滋味物質(zhì)[1]，能興奮中樞神經(jīng)從而消除疲勞感，還具有抑菌、抗癌、抗肥胖等功效[2]。在綠茶及烏龍茶這些不發(fā)酵茶或?yàn)榘l(fā)酵茶的加工過程中，咖啡堿含量基本保持穩(wěn)定或有些微的降低[3-4]，而在普洱茶和茯茶等黑茶加工中，由于大量微生物參與了渥堆發(fā)酵過程，導(dǎo)致產(chǎn)品中咖啡堿含量的明顯增長(zhǎng)[5-6]?？Х葔A含量的消長(zhǎng)是黑茶品質(zhì)形成及其健康功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。目前，國際市場(chǎng)上的咖啡堿主要來源于化學(xué)合成，受潛在的化學(xué)污染物質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)影響，其在食品行業(yè)和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用受到限制[7]。因此，污染低、安全性高的生物合成咖啡堿越來越受關(guān)注。

在富含咖啡堿的植物，如咖啡和茶樹中，咖啡堿合成路徑是黃嘌呤核苷→7-甲基黃嘌呤核苷→7-堿基黃嘌呤→可可堿→咖啡堿，即是以黃嘌呤核苷為底物，以N-7、N-3、N-1順序進(jìn)行3 次甲基化[8-10]。此外也有研究指出微生物中咖啡堿合成可能還存在一條有別于植物體內(nèi)合成咖啡堿的途徑，以N-3、N-1、N-7的順序進(jìn)行甲基化，以黃嘌呤為底物逐步生成咖啡堿[11-12]。因此，在微生物中增加咖啡堿合成途徑中黃嘌呤的含量，對(duì)實(shí)現(xiàn)咖啡堿無底物從頭合成及提高咖啡堿產(chǎn)量都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

鳥嘌呤脫氨酶又稱鳥嘌呤酶或鳥嘌呤氨基水解酶，是一種鋅金屬酶[13]，也是核苷酸代謝的關(guān)鍵酶，分別在1982、1998年及1999年被證實(shí)可在脈孢菌、嗜鹽古菌和哺乳類動(dòng)物中催化鳥嘌呤脫氨降解生成黃嘌呤后合成核苷酸[14-17]。嘌呤、嘧啶在作為碳源及氮源時(shí)，脫氨步驟是第一步，這也是降解途徑和補(bǔ)償途徑的基礎(chǔ)步驟[18]。但是因?yàn)猷堰蚀x的補(bǔ)償途徑是不對(duì)稱的，只有腺嘌呤衍生物可以轉(zhuǎn)變成鳥嘌呤核苷酸，而相反的路徑卻不存在，因此鳥嘌呤脫氨酶在鳥嘌呤分解代謝中扮演著重要角色[19-20]。植物體中關(guān)于鳥嘌呤脫氨酶的研究較少，Negishi等[21]曾在茶樹葉片中檢測(cè)到了鳥嘌呤脫氨酶活性，只是尚未發(fā)現(xiàn)完整的基因序列。目前關(guān)于鳥嘌呤脫氨酶的研究主要集中在動(dòng)物肝臟及微生物方面[22-23]。研究顯示，雖然鳥嘌呤脫氨酶是嘌呤代謝基礎(chǔ)酶，但是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布并不均勻，例如在小鼠體內(nèi)是在小腸近端部分含有最高水平，僅在小鼠腦內(nèi)不同區(qū)域鳥嘌呤脫氨酶含量就有近50 倍的差異[16,24-26]。本研究分別從釀酒酵母和大腸桿菌中克隆出鳥嘌呤脫氨酶基因gud1和egud，構(gòu)建重組載體進(jìn)行原核表達(dá)分析，嘗試在生物體內(nèi)大量積累黃嘌呤，通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)體內(nèi)及體外產(chǎn)物，分析鑒定基因功能，嘗試為豐富黑茶加工技術(shù)理論作出探索，同時(shí)為無底物合成咖啡堿和提高咖啡堿產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

表達(dá)菌株大腸桿菌BL21（DE3）、感受態(tài)大腸桿菌TransT1、DNA Marker、Protein Marker II 北京全式金公司；表達(dá)載體pMAL-c5X由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹生物學(xué)與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；rTaq酶、限制性內(nèi)切酶 寶生物工程（大連）有限公司；ClonExpress?II One Step Cloning Kit 諾唯贊生物科技有限公司；引物合成及測(cè)序由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司完成；HPLC所用試劑均為色譜級(jí)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Alliance高效液相色譜儀、ODS C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國Waters公司；S1000TMThermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocTMMP Imaging System）、Power PAC 3000電泳儀 美國Bio-Rad公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝儀器研究所；5424R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；DHG-9031A電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZF-50L高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 利用ClonExpress?II One Step Cloning Kit克隆目的基因

根據(jù)gud1和egud序列，按試劑盒說明，利用CE Design V1.04軟件設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，將gud1和egud分別連接到pMAL-C5X。為方便連接目的基因和表達(dá)載體，在引物中引入BamHI酶切位點(diǎn)，引物序列如下（下劃線處為添加的酶切位點(diǎn)）：egud-F：5’-cgcgatatc gtcgacggatccATGATGTCAGGAGAACACACGTTA-3’，egud-F：5’-acctgcagggaattcggatccTTAGTTGCGTTCGTA CACCAGACG-3’；gud1-F：5’-cgcgatatcgtcgacggatccATG ACAAAAAGTGATTTATTATTTGATA-3’，gud1-F：5’-ac ctgcagggaattcggatccCTAAATCTGGTAGACTTGCTGG CC-3’。

以大腸桿菌BL21（DE3）菌株和釀酒酵母INVSCI菌株為試材，因兩種菌株皆沒有內(nèi)含子，直接以粗樣品為模板，用KOD FX Neo擴(kuò)增egud和gud1。PCR體系：2×PCR buffer 25 μL，2 mmol/L dNTPs 10 μL，KOD FX Neo 1 μL， Primer F（10 μmol/L）1.5 μL ，Primer R（10 μmol/L）1.5 μL，補(bǔ)ddH2O至50 μL，超凈臺(tái)中挑菌少許，該體系均分成2 管進(jìn)行PCR。PCR程序（35 個(gè)循環(huán)）如下：94 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 80 s，68 ℃ 10 min，4 ℃ ∞。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的條帶。

1.3.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

對(duì)表達(dá)載體質(zhì)粒pMAL-c5X進(jìn)行單酶切，酶切體系為：10×K buffer 2 μL，BamHI 1 μL，DNA 2～5 μL（不大于1 μg），補(bǔ)ddH2O至20 μL。上述體系30 ℃水浴條件下反應(yīng)1 h，產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，用膠回收試劑盒純化產(chǎn)物。與PCR回收產(chǎn)物重組連接，反應(yīng)體系：5×CE II buffer 4 μL，Exnase?II 2 μL，Linearized Vector 5 μL，Purified PCR Fragment 0.5 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。上述體系于37 ℃反應(yīng)30 min進(jìn)行連接，反應(yīng)完成后及時(shí)冰浴5 min終止反應(yīng)，將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入50 μL大腸桿菌TransT1感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30 min，然后將離心管置于45 ℃水浴45 s，冰浴中冷卻2 min。在超凈工作臺(tái)中分別向離心管中加入500 μL LB培養(yǎng)基，混勻后37 ℃條件下200 r/min培養(yǎng)1 h。1 h后吸取100 μL菌液均勻涂布到含有氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)后蘸取少量菌體進(jìn)行菌落PCR，挑取陽性菌落送通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的陽性菌落挑菌初步培養(yǎng)，用試劑盒提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至大腸桿菌BL21（DE3）。

1.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

篩選陽性菌落于3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃條件下200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。次日取800 μL過夜菌液接種于40 mL新鮮LB培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8。取1 mL菌液于12 000 r/min下離心5 min后，取上清液作為誘前對(duì)照。在剩余菌液中加入終濃度為1 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)，分別16 ℃誘導(dǎo)20 h，30 ℃誘導(dǎo)8 h，確定最佳誘導(dǎo)溫度及時(shí)間。

1.3.4 酶活性檢測(cè)

1.3.4.1 體外酶活性檢測(cè)

選取最佳誘導(dǎo)條件，進(jìn)行融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，200 mL誘導(dǎo)后菌液冷凍離心（4 ℃，6 000 r/min）20 min收集菌體。加入20 mL Lysis Buffer（現(xiàn)加二硫蘇糖醇，終濃度為5 mmol/L）重懸菌體，冰浴條件進(jìn)行超聲破碎，破碎結(jié)束離心得上清液即粗酶液，將粗酶液過麥芽糖結(jié)合MBP層析柱進(jìn)行純化。

5 mL酶反應(yīng)體系[20]：MgCl2250 μL，鳥嘌呤溶液50 μL，純化后的酶液200 μL，無菌水4.5 mL，混合體系37 ℃反應(yīng)，分別取反應(yīng)0、5、10、30、60 min的樣品，離心后過0.22 μm水相濾膜，通過HPLC檢測(cè)酶反應(yīng)產(chǎn)物。以未插入目的基因的空載體pMAL-c5X相同處理作對(duì)照。

1.3.4.2 體內(nèi)酶活性檢測(cè)

40 mL菌液誘導(dǎo)后，分為兩組，一組不作處理，一組加入4 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的鳥嘌呤為底物，將菌液移入37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24 h取一次樣，將菌液12 000 r/min離心10 min，按1∶50的比例取上清液稀釋，稀釋液過0.22 μm水相濾膜，通過HPLC檢測(cè)酶反應(yīng)產(chǎn)物。

高效液相色譜條件：流速1 mL/min；流動(dòng)相：A相0.2%乙酸，B相純乙腈；紫外檢測(cè)器吸收波長(zhǎng)為274 nm。線性變化范圍：0～4 min，A相95%，B相5%；4～10 min，A相40%，B相60%；10～13 min，A相95%，B相5%；13～30 min，A相95%，B相5%。

1.3.5 表達(dá)酶的同源建模以及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用DNAMAN軟件進(jìn)行GUD1和EGUD的氨基酸序列進(jìn)行分析比對(duì)比，參考Dai Xinlong等[27]的建模方法，使用SWISS-MODEL在線軟件（http://swissmodel.expasy.org/interactive）利用相似度高的已知三維結(jié)構(gòu)的蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)模型，對(duì)GUD1和EGUD進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)的同源建模，并使用Molegro virtual docker軟件以此對(duì)目的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。

1.4 圖像處理

PCR擴(kuò)增圖像、結(jié)合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)圖像及蛋白純化圖像都是利用伯樂ChemiDoc?MP Imaging System照膠成像所得并進(jìn)行后續(xù)編輯；色譜圖為HPLC儀檢測(cè)編輯并用Excel進(jìn)行后續(xù)處理；蛋白晶體模型使用Molegro virtual docker軟件進(jìn)行編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 gud1和egud的原核表達(dá)載體的構(gòu)建

挑取少量大腸桿菌BL21（DE3）和釀酒酵母INVSCI，用KOD FX Neo分別擴(kuò)增gud1和egud（圖1），在1 000～2 000 bp之間分別可見兩條特異性條帶，產(chǎn)物大小與gud1 ORF的長(zhǎng)度1 470 bp、egud ORF的長(zhǎng)度1 320 bp相符?；厥誔CR擴(kuò)增產(chǎn)物，與pMAL-c5X表達(dá)載體通過Exnase?II重組連接，構(gòu)建pMAL-gud1和pMAL-egud表達(dá)載體。

圖1 gud1和egud編碼區(qū)的擴(kuò)增Fig. 1 Amplification of encoding regions of gud1 and egud genes

2.2 pMAL-egud和pMAL-gud1誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化

為確定EGUD和GUD1蛋白最佳誘導(dǎo)條件，加入1 mmol/L IPTG在16 ℃和30 ℃分別誘導(dǎo)20 h和8 h，制樣進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）檢測(cè)。在兩個(gè)溫度下均可誘導(dǎo)得到90 kDa左右的可溶性目的蛋白（圖2），與融合蛋白大小一致（空載標(biāo)簽子MBP大小為40 kDa，EGUD和GUD1蛋白理論值大小51.22 kDa和55.21 kDa）。而且16 ℃誘導(dǎo)20 h蛋白表達(dá)效果明顯比30 ℃誘導(dǎo)效果好，融合蛋白大量表達(dá)在上清液中，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均在16 ℃、20 h誘導(dǎo)條件下進(jìn)行。將菌液誘導(dǎo)結(jié)束后制取粗酶液，利用麥芽糖結(jié)合MBP層析柱進(jìn)行純化，獲得單一條帶（圖3）。

圖2 pMAL-egud和 pMAL-gud1誘導(dǎo)蛋白SDS-PAGE圖Fig. 2 Induced protein expression of pMAL-egud and pMAL-gud1 revealed by SDS-PAGE electrophoresis

圖3 pMAL-gud1、pMAL-egud目的蛋白純化Fig. 3 Purification of target protein pMAL-gud1 and pMAL-egud

2.3 EGUD和GUD1體外活性檢測(cè)結(jié)果

圖4 pMAL-gud1和pMAL-egud產(chǎn)物體外酶活性的HPLC分析Fig. 4 In vitro activity analysis of pMAL-gud1 and pMAL-egud by HPLC

如圖4所示，對(duì)照組pMAL-c5X無法生成黃嘌呤，與對(duì)照組相比，樣品組pMAL-gud1和pMAL-egud添加的底物鳥嘌呤均有所下降并且生成黃嘌呤質(zhì)量濃度分別達(dá)到了619.3 μg/mL和527.9 μg/mL。

2.4 EGUD和GUD1體內(nèi)活性檢測(cè)結(jié)果

圖5 pMAL-gud1和pMAL-egud產(chǎn)物體內(nèi)酶活性的HPLC分析Fig. 5 In vivo activity of pMAL-gud1 and pMAL-egud analyzed by HPLC

菌液誘導(dǎo)后制樣通過HPLC檢測(cè)EGUD和GUD1體內(nèi)酶活性，結(jié)果見圖5。在兩種處理下，對(duì)照組中轉(zhuǎn)入空載的菌株也都能產(chǎn)生黃嘌呤，但是與重組菌株相比較發(fā)現(xiàn)，無底物培養(yǎng)時(shí)重組菌株產(chǎn)物明顯黃嘌呤產(chǎn)量高于對(duì)照組，轉(zhuǎn)入pMAL-gud1和pMAL-egud質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組菌株對(duì)照轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的對(duì)照組菌株，黃嘌呤產(chǎn)量由110 μg/mL分別提高到225 μg/mL和191 μg/mL；加底物培養(yǎng)時(shí)實(shí)驗(yàn)組底物鳥嘌呤消耗速度相比對(duì)照組更快，且黃嘌呤的產(chǎn)量更高，轉(zhuǎn)入pMAL-gud1和pMAL-egud質(zhì)粒的實(shí)驗(yàn)組菌株對(duì)照轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的對(duì)照組菌株，黃嘌呤產(chǎn)量由180 μg/mL分別提高到312 μg/mL和267 μg/mL。

2.5 EGUD和GUD1的同源建模及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過SWISS-MODEL在線軟件對(duì)GUD1和EGUD蛋白進(jìn)行同源建模，分別以Guad（SMTL id：2uz9.1）和Blr3880（SMTL id：200D.1）蛋白為模型，建造了GUD1和EGUD的三維晶體模型（圖6），重合度分別達(dá)到了41.15%和44.72%，并以此對(duì)二者的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，如圖7所示，GUD1二級(jí)結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主，α-螺旋較多較集中，EGUD二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋與β-折疊程度相似，但是β-折疊較α-螺旋更為分散。

圖6 GUD1和EGUD三維晶體同源建模Fig. 6 3D crystal modeling of GUD1 and EGUD

圖7 GUD1和EGUD二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 7 Predicted secondary structures of GUD1 and EGUD

3 討 論

本研究在大腸桿菌中分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母的鳥嘌呤脫氨酶基因gud1和大腸桿菌鳥嘌呤脫氨酶基因egud構(gòu)建重組質(zhì)粒。由于低溫有利于增強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定性和正確折疊，獲得可溶性蛋白的可能性較大，而不易形成包涵體[28]，所以實(shí)驗(yàn)過程中利用IPTG在16 ℃低溫誘導(dǎo)，從而使大腸桿菌中可以大量產(chǎn)生黃嘌呤。本研究構(gòu)建的工程菌在轉(zhuǎn)入含gud1和egud的質(zhì)粒后，對(duì)比轉(zhuǎn)入空載pMAL-c5X的大腸桿菌，在加入鳥嘌呤作底物時(shí)，120 h后黃嘌呤產(chǎn)量由180 μg/mL分別提高到312 μg/mL和267 μg/mL，鳥嘌呤消耗速度分別提高了61%和49%；在不加入底物的情況下，120 h后黃嘌呤產(chǎn)量由110 μg/mL分別提高到225 μg/mL和191 μg/mL。對(duì)分別轉(zhuǎn)入gud1和egud的菌株相進(jìn)行比較，前者生成黃嘌呤的效率更高，說明GUD1比EGUD催化效率更高，有更高的酶活性?？赡苁且?yàn)轼B嘌呤脫氨酶催化鳥嘌呤脫氨生成黃嘌呤是初級(jí)代謝反應(yīng)，相比于大腸桿菌，酵母是真核生物，有更為復(fù)雜的生理代謝，導(dǎo)致基礎(chǔ)代謝也更為旺盛，或鳥嘌呤脫氨酶有不同的折疊方式和晶體結(jié)構(gòu)，在真核生物和原核生物中因三維結(jié)構(gòu)不同造成GUD1比EGUD酶活性更高[29]。后續(xù)研究中可以考慮通過以下措施優(yōu)化基因表達(dá)，提高黃嘌呤表達(dá)量：控制培養(yǎng)條件以提高質(zhì)粒穩(wěn)定性與拷貝數(shù)，減少代謝副產(chǎn)物積累，提高外源蛋白產(chǎn)率；更換表達(dá)載體，將Lac啟動(dòng)子換成更強(qiáng)的T7啟動(dòng)子等[30-31]。

與綠茶等不發(fā)酵或輕微發(fā)酵茶相比，茶葉中內(nèi)源酶在殺青過程中已經(jīng)失活，渥堆和發(fā)花過程中，微生物來源的外源酶成為發(fā)酵中最主要的生物催化劑，在適宜的水分和溫度條件下，黑曲霉、冠突散囊菌、酵母等微生物以茶葉中存留的鳥嘌呤等堿基為底物合成了黃嘌呤，為渥堆和發(fā)花過程中咖啡堿的生物合成提供了底物[32]。

目前，咖啡堿在植物中的生物合成途徑已經(jīng)基本明確，但是構(gòu)建工程菌生物合成咖啡堿應(yīng)還有待進(jìn)一步研究。本研究以黃嘌呤為底物合成咖啡堿的新途徑入手，通過提高咖啡堿合成途徑中底物黃嘌呤的生成量，以期達(dá)到提高咖啡堿合成量的目標(biāo)。研究結(jié)果表明，無論是否添加外源底物（鳥嘌呤），轉(zhuǎn)入gud1和egud的菌株都明顯比對(duì)照菌株生成了更多的黃嘌呤。研究結(jié)果將為黑茶渥堆技術(shù)提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為體外構(gòu)建高效咖啡堿生物工程菌提供依據(jù)。