任冬花 關(guān) 巍 馮喜英 李西玲 趙 立

(西寧市第二人民醫(yī)院呼吸科，青海 西寧 810003)

支氣管哮喘的發(fā)生及不斷發(fā)展與大量的細(xì)胞參與密不可分。這些細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞等同時(shí)這些細(xì)胞分泌的大量細(xì)胞因子也都參與了這一過程。近來研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的移植可以有效改善過敏性氣道炎癥〔1～4〕。究其原理發(fā)現(xiàn)，首先BMSCs的多向分化能力，移植的BMSCs在生理刺激下快速分化形成氣管類細(xì)胞〔5〕，同時(shí)還有免疫調(diào)節(jié)作用〔6～8〕，BMSCs可以調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg的比例，從而改善氣道炎癥，具有治療支氣管哮喘的臨床前景。同時(shí)BMSCs不易被機(jī)體的免疫細(xì)胞所識(shí)別，可以有效逃脫免疫系統(tǒng)的攻擊排斥反應(yīng)，從而達(dá)到治療目的。本研究探討B(tài)MSCs逆轉(zhuǎn)支氣管哮喘小鼠氣道重構(gòu)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，SPF級(jí)8周齡雄性SD大鼠27只，體重(200±10)g(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，CKX31型倒置顯微鏡(日本 Olympus 公司)，DMEM、胰酶、EDTA(Gibco公司，美國(guó))，TaqMix(東盛生物公司)，培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，10 cm2培養(yǎng)皿、96孔板(美國(guó) Corning 公司)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，超凈工作臺(tái)SCW-HS-840型 (蘇州市長(zhǎng)春電子儀器廠)，培養(yǎng)箱(Queue systems TM2711美國(guó))，深低溫冰箱(SANYO，AltraLow日本)，全能型高性能臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Heaeus，BiofugeStratos德國(guó))，蒸汽高壓消毒箱(Tuttnauer，2540MK美國(guó))，細(xì)胞計(jì)數(shù)板 (SCW-HZ型上海醫(yī)療設(shè)備廠)，卵清蛋白 (OVA，Sigma公司)，Al(OH)3凝膠 (Sigma公司)，流式細(xì)胞儀，Anti-CD25-PE (美國(guó)BD公司)，Anti-CD45-FITC(美國(guó) BD公司)。

1.2BMSCs的培養(yǎng) 采用SPF級(jí)SD大鼠，用水合氯醛麻醉，在嚴(yán)格無菌條件下分離出大鼠股骨，用DMEM沖洗骨髓腔后，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2次后用DMEM混懸細(xì)胞，加入淋巴分離液，分離得到淋巴細(xì)胞，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分為哮喘組(10只)，治療組(10只)，空白對(duì)照組(10只)。哮喘組和治療組分別在1 d、8 d使用OVA腹腔注射致敏，第15、16、17天使用OVA氣道內(nèi)滴入激發(fā)哮喘?？瞻讓?duì)照組在第14天激發(fā)后腹腔注射2 ml含1×107個(gè)BMSCs的培養(yǎng)液?？瞻讓?duì)照組全部采用等量PBS處理。

1.4支氣管肺泡灌洗液提取及檢測(cè) 造模完成后48 h，采用0.3%戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，將大鼠氣管切開，插管，生理鹽水0.5 ml/次，重復(fù)灌洗2次。將取得的支氣管肺泡灌洗液，1 500 r/min離心10 min，PBS清洗2次，然后將細(xì)胞沉淀用100 ml PBS重懸，取10 μl用于細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞分類，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞各占的百分比。

1.5取血進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè) 對(duì)大鼠經(jīng)眼眶摘眼球采血，滴入肝素抗凝管內(nèi)，3 000 r/min離心20 min，將血清裝移至另外干凈的1.5 ml EP管中，-20℃保存，待測(cè)血清白細(xì)胞介素(IL)-4及干擾素(IFN)-γ含量。

1.6取血進(jìn)行流式檢測(cè) 對(duì)大鼠經(jīng)眼眶摘眼球采血，滴入肝素抗凝管內(nèi)，取 50 μl 血標(biāo)本，加入 5 μl鼠抗CD4-PE、5 μl鼠抗CD25-FITC，混勻，避光孵育20 min，加入紅細(xì)胞裂解液1 ml，混勻，避光孵育10 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，再用 PBS 2 ml洗1遍，棄上清，加入 200 μl PBS，用流式細(xì)胞儀(BD 公司)檢CD4+CD25+Treg。

1.7病理切片檢測(cè) 采集血液及肺泡灌洗液后將各組大鼠處死取出肺組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋后進(jìn)行切片，進(jìn)行HE染色，觀察病理學(xué)改變。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1BMSCs的分離及純化 將淋巴分離液分離到的骨髓細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，在 24 h后可見細(xì)胞貼壁，72 h后洗滌細(xì)胞除去未貼壁的細(xì)胞，7 d左右形成數(shù)十個(gè)細(xì)胞集落，細(xì)胞快速增長(zhǎng)，培養(yǎng)2 w后細(xì)胞長(zhǎng)滿70%～80%，進(jìn)行細(xì)胞傳代。在光學(xué)纖維鏡下觀察細(xì)胞均成梭形細(xì)胞集落，見圖1。

圖1 BMSCs培養(yǎng)48 h的形態(tài)(×200)

2.2肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)情況 小鼠構(gòu)建支氣管哮喘模型成功后肺部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，在肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)上的主要表現(xiàn)為，嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的比例都顯著升高，與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 各組肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.01，下表同

2.3各組IL-4、IFN-γ的水平 哮喘組和治療組IL-4水平較空白對(duì)照組明顯升高，IFN-γ水平較空白對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 各組血清IL-4和IFN-γ水平比較

2.4各組外周血CD4+CD25+Treg的表達(dá)情況 哮喘組CD4+CD25+Treg的比例〔(3.10±1.23)%〕較空白對(duì)照組顯著減少〔(5.62±0.45)%,P<0.01〕，治療組CD4+CD25+Treg比例〔(5.12±3.45)%〕較哮喘組顯著增高，但顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)。

2.5肺組織HE染色結(jié)果 與空白對(duì)照組相比，哮喘組與治療組可以看到顯著的炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，同時(shí)在血管和支氣管附近也有炎癥細(xì)胞的遷移，同時(shí)血管附近還有水腫的現(xiàn)象。在小氣道則出現(xiàn)上皮細(xì)胞的破壞及上皮層的增生，還有部分地方可以見到有黏液栓出現(xiàn)，見圖2。

圖2 各組肺組織HE切片結(jié)果(×200)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘發(fā)生時(shí)氣道會(huì)出現(xiàn)一系列的變化，主要表現(xiàn)為大量炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)包括肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，這些細(xì)胞的活化和增殖能夠?qū)е露喾N細(xì)胞因子、毒性蛋白及其他脂類等物質(zhì)的釋放〔9～12〕。這些物質(zhì)可以直接或間接損傷氣道結(jié)構(gòu)，使氣管上皮黏膜大量脫落同時(shí)還有部分出現(xiàn)黏液栓塞〔13，14〕。 目前支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘的發(fā)生和發(fā)展不僅和氣道的局部環(huán)境有關(guān)而且還有全身免疫器官和免疫細(xì)胞的參與。特別是Th1/Th2的平衡失調(diào)情況，出現(xiàn)Th2活化而Th1數(shù)量減少，這是支氣管哮喘發(fā)生的重要原因之一〔15～20〕。而IFN-γ和IL-4作為Th1/Th2細(xì)胞的代表因子，也被公認(rèn)為能夠調(diào)節(jié)哮喘的發(fā)生和發(fā)展過程。支氣管哮喘時(shí)，IL-4不斷增加，增加的IL-4可以刺激Th0細(xì)胞不斷向Th2分化，從而誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖、分化及活化〔21，22〕。同時(shí)還可以刺激B細(xì)胞分泌IgE因子，增加內(nèi)皮細(xì)胞分泌T細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的能力。在Th2不斷增殖時(shí)則會(huì)抑制Th1的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致IFN-γ分泌減少〔23～25〕。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘組和治療組IL-4明顯增加，同時(shí)IFN-γ顯著減少，進(jìn)一步驗(yàn)證了在支氣管哮喘過程中Th1/Th2比例出現(xiàn)了失衡。

研究發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘的發(fā)生同時(shí)伴隨外周的免疫缺陷的機(jī)制的發(fā)生〔11，26～29〕，CD4+CD25+Treg是調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以調(diào)節(jié)自身免疫耐受的機(jī)制。因此支氣管哮喘的發(fā)生同時(shí)會(huì)影響CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例，近期研究發(fā)現(xiàn)通過檢測(cè)治療后支氣管哮喘患者發(fā)現(xiàn)治療后患者CD4+CD25+Treg比例明顯升高。

MSCs是一類來源于骨髓中胚層的非造血干細(xì)胞，其具有多種的分化潛能，是目前廣泛應(yīng)用的生物工程種子細(xì)胞〔7，30，31〕。BMSCs作為種子細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)主要為：①BMSCs具有不斷分化及增殖的能力，因此BMSCs可以用于治療和損傷的修復(fù)工作；②免疫耐受性，BMSCs具有逃避免疫細(xì)胞和免疫器官損傷的特性因此采用BMSCs進(jìn)行移植治療可以避免其他移植的排斥反應(yīng)從而應(yīng)用于身體各個(gè)部位的損傷治療；③免疫調(diào)節(jié)性能，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs具有調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg的功能，通過調(diào)節(jié)CD4+CD25+Treg的比例，同時(shí)減少炎癥細(xì)胞和炎癥因子的數(shù)量〔32，33〕;④易分離且易培養(yǎng)，BMSCs可以從股骨中分離出來，且體外培養(yǎng)條件比較成熟使其在分離和培養(yǎng)的過程都比較容易實(shí)現(xiàn)。BMSCs 主要是通過調(diào)節(jié)肺氣道損傷的微環(huán)境來進(jìn)一步治療支氣管哮喘，同時(shí)BMSCs還可以有效防止支氣管哮喘后期肺部的纖維化和膠原聚集的現(xiàn)象〔34，35〕。

綜上所述，BMSCs可以移植后可以有效遷移到肺損傷部位，同時(shí)通過調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境可以達(dá)到逆轉(zhuǎn)支氣管哮喘小鼠氣道重構(gòu)的目的，其治療機(jī)制可能與CD4+CD25+Treg及細(xì)胞因子等有關(guān)。但BMSCs治療效果與淋巴細(xì)胞的具體反應(yīng)機(jī)制還需后續(xù)研究。