楊潔泉 武步強(qiáng) 王 武

(長治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院普外一科，山西 長治 046000)

目前胃癌診斷主要手段是胃鏡及鏡下的活檢。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步〔1〕，胃癌的診斷治療手段取得了長足的進(jìn)步。但是早期胃癌的檢出率只有10%～20%〔2,3〕。因此，尋找新的高敏感性和高特異性的腫瘤標(biāo)志物，對胃癌的診斷及治療具有重要的意義〔4〕。微小RNA(miRNA)與靶基因的mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)完全或部分結(jié)合，使得mRNA降解或者抑制翻譯產(chǎn)物的生成，從而參與調(diào)控個體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化〔5～8〕。miRNA-30 家族作為 miRNAs 的重要組成部分,在人類和動物 miRNA的功能研究中起著不容忽視的作用。miRNA-30包括miR-30a、miRNA-30b 、miRNA-30c、miRNA-30d 和miRNA-30e。本文探討胃癌組織中miRNA-30c的表達(dá)及意義。

1 材料和方法

1.1材料 胃組織標(biāo)本取自2005年4月至2007年5月長治醫(yī)學(xué)院附屬和中醫(yī)院就診的胃癌患者。分別取癌中央部位組織和對應(yīng)的癌旁正常胃黏膜組織。切除標(biāo)本后，10 min內(nèi)立即將組織儲存于液氮罐中。所有標(biāo)本病理明確診斷為胃癌。所有患者簽署知情同意書。男37例，女68例，中位年齡66歲。胃癌細(xì)胞株NCI-N87、SGC-7901、MKN-49P、MGC-803和BGC-823，正常人胃上皮細(xì)胞GES-1購自ATCC細(xì)胞庫。細(xì)胞使用含有1%鏈霉素-氨芐青霉素，10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，并在37℃，含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。RNA提取試劑盒(Thermo Scientific KingFisher Total RNA Kit)購自美國Thermo公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時PCR試劑盒均購自德國QIAGEN公司。miRNA-30c mimic和抑制劑購自上海吉瑪公司〔9〕。

1.2RNA提取 胃癌細(xì)胞系及胃癌組織與癌旁組織RNA的提取均采用Thermo試劑盒按照說明書進(jìn)行操作〔10〕。提取出來的RNA經(jīng)A260/A280比值檢測，比值均為1.8～2.0，可進(jìn)行下一步操作。

1.3RNA逆轉(zhuǎn)錄及定量 取1 μg提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。通過使用High Capacity cDNA Synthesis試劑盒(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和miRNA特異性引物完成cDNA的合成。引物如下：miRNA-30c:GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG-ATACGACAGCTGAG，同時反轉(zhuǎn)錄內(nèi)參U6。miRNA表達(dá)的實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)分析使用如下引物進(jìn)行。miRNA-30c:正義鏈5′-GGGGTGTAAACATCCTACACTC-3′;反義鏈5′- ATTGCGTGTCGTGGAGTCG -3′;U6:正義鏈5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′;反義鏈5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。所有待測項(xiàng)目設(shè)立3個反應(yīng)復(fù)孔。采集熒光信號，miRNA表達(dá)水平以倍數(shù)=2-ΔΔCt表示〔11,12〕。

1.4MTT法分析 選取生長密度為60%～80%的細(xì)胞進(jìn)行miRNA-30c mimic或抑制劑轉(zhuǎn)染。24 h后將細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液。用血球計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。鋪板細(xì)胞密度1 000個/孔，每組6復(fù)孔，連續(xù)檢測4 d，鋪板過程中要確保每孔加入細(xì)胞數(shù)目的一致。統(tǒng)一鋪好板后，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從鋪板后第2天開始，培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入10 μl 5 g/L的MTT，無需換液。4 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)終止反應(yīng)。振蕩器振蕩5～10 min，酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光值〔13,14〕。

1.5術(shù)后生存率 105例患者都進(jìn)行術(shù)后隨訪，隨訪期5年。生存時間以術(shù)后第1天開始計算，直至患者死亡或電話隨訪最后日期，以月為單位進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier和Log-rank方法分析miRNA-30c表達(dá)與患者生存率的關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1miRNA-30c在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá) miRNA-30c在大部分胃癌組織中表達(dá)顯著降低。胃癌細(xì)胞系中miRNA-30c的表達(dá)低于正常胃上皮細(xì)胞。

2.2miRNA-30c表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 miRNA-30c的表達(dá)水平在不同性別、腫瘤大小、腫瘤分化水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高齡患者miRNA-30c的表達(dá)明顯低于年齡較小患者，且隨著腫瘤的分期增加miRNA-30c的表達(dá)降低，表明miRNA-30c可能具有抑制胃癌的作用，見表1。

表1 miRNA-30c表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

2.3miRNA-30c表達(dá)與胃癌患者總生存期的相關(guān) 以ΔΔCt=-1.26為界值將miRNA-30c的表達(dá)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。Kaplan-Meier分析顯示，高表達(dá)組患者預(yù)后明顯好于低表達(dá)組(P=0.03)，中位生存期分別為53(16～60)和41(12～60)個月(圖1)。通過Log-rank分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-30c可以作為獨(dú)立的預(yù)后因子。

2.4miRNA-30c抑制胃癌細(xì)胞的增殖 對miRNA-30c固有表達(dá)低的BGC-823細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-30c mimic(miRNA-30C表達(dá)為297.00±1.356)或空白mimic(miRNA-30C表達(dá)為0.978±0.233)，對miRNA-30c固有表達(dá)高的NCI-N87細(xì)胞系轉(zhuǎn)染miRNA-30c抑制劑(miRNA-30C表達(dá)為0.212±0.036)或空白抑制劑(miRNA-30C表達(dá)為0.951±0.200)。MTT結(jié)果表明miRNA-30c的過表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖，而抑制miRNA-30c后，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖(P<0.05，P<0.01)，見圖2，3。

圖1 miRNA-30c與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

與空白mimic組比較：1)P<0.05圖2 miRNA-30c過表達(dá)對BGC-823細(xì)胞增殖的影響

與空白抑制劑組比較：1)P<0.05；2)P<0.01圖3 miRNA-30c敲除后對NCI-N87細(xì)胞增殖的影響

3 討 論

miRNA-30通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為來調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在肝癌、乳腺癌、肺癌、消化系統(tǒng)腫瘤中都發(fā)揮著重要作用〔15,16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是組織水平還是細(xì)胞水平，miRNA-30c的表達(dá)都是下降的，并且和腫瘤的分期及胃癌患者的預(yù)后呈正相關(guān)。miRNA-30c過表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖。miRNA在人體發(fā)育的不同階段有著不同的功能，并且其功能具有組織特異性。單個miRNA靶基因成千上萬。一個miRNA可以與多個靶基因結(jié)合，而一個靶基因又可以同時受多個miRNA的調(diào)節(jié)〔17〕。因此miRNA與靶基因之間可以形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。腫瘤是由不可控制的細(xì)胞增殖和不恰當(dāng)?shù)膿p傷細(xì)胞存活引起的。細(xì)胞本身有多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞正常的分裂、分化和死亡。通過一系列基因的活化或者沉默精確地調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化。在腫瘤當(dāng)中，可以選擇性地開啟或者關(guān)閉某些癌基因或者抑癌基因的功能。miRNA通過序列特異性的堿基配對抑制mRNA的翻譯功能，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、分化和凋亡。研究表明非編碼miRNA是胃癌發(fā)生的主要因素之一，其對胃癌細(xì)胞的周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移都有重要影響〔18〕。

不足20%的早期胃癌可以得到診斷，80%的患者就診時已為進(jìn)展期胃癌，即已經(jīng)發(fā)生肌層、漿膜層浸潤或轉(zhuǎn)移，5年生存率很低。因此，尋找胃癌的生物標(biāo)志物對于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和治療胃癌及協(xié)助臨床治療十分迫切，并且有助于臨床醫(yī)生制定合適的治療方案，以取得效果最優(yōu)化。現(xiàn)階段，胃癌的早期診斷主要依靠內(nèi)鏡下活檢來進(jìn)行，但是內(nèi)鏡下活檢為侵入性操作，有一定的風(fēng)險性。而miRNA不僅可以從組織當(dāng)中提取，而且近年研究顯示，miRNA還能夠游離于細(xì)胞之外，穩(wěn)定存在于血漿或血清中，具備疾病分子生物標(biāo)志物的某些特點(diǎn)，在多種腫瘤和非腫瘤疾病的診斷和預(yù)后中顯示了獨(dú)特的價值〔15,16〕。本研究揭示了miRNA-30c在胃癌中可能發(fā)揮抑癌作用，為胃癌的早期診斷，預(yù)后判斷和藥物開發(fā)提供了理論依據(jù)。