娜日蘇 韓志強(qiáng) 安 達(dá) 巴圖德力根

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙醫(yī)臨床藥理研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

糖尿病伴腎損害是糖尿病最嚴(yán)重最常見的微血管并發(fā)癥之一，不加控制會發(fā)展為糖尿病腎病(DN)，是糖尿病患者致死的主要原因之一〔1〕。糖尿病伴腎損害屬于蒙醫(yī)“希京病”范疇，蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病是由于三根七素之平衡失調(diào)而巴達(dá)干偏盛并與赫依交博，導(dǎo)致肝腎燥熱而功能衰退，精華與糟粕分解失常所致的一種遷延難愈的病癥〔2〕。蒙藥薩麗嘎日迪源自蒙醫(yī)經(jīng)典著作《至高要方》，具有清腎熱，消“黏”，固精功能，主要用于腎寒腎熱諸癥，腰膝疼痛，夢遺滑精，睪丸腫大〔3〕。研究顯示，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)與DN早期腎小球的病理變化、血管內(nèi)皮功能病變相關(guān)〔4〕。本課題采用鏈脲佐菌素(STZ)所致大鼠糖尿病模型，研究蒙藥薩麗嘎日迪對糖尿病伴蛋白尿大鼠腎組織修復(fù)作用及對腎組織VEGF表達(dá)和血清轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及用藥 Wistar大鼠，封閉群，SPF級，170～190 g，雄性，70只，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(吉)-2011-0004。薩麗嘎日迪：由藏紅花，訶子，制草烏，木香，白豆蔻，石菖蒲，大蜀季，刀豆，牛膽粉等17種藥材組成，購自內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室(批準(zhǔn)文號：哲衛(wèi)準(zhǔn)字9804-33)。

1.2主要試劑及儀器 STZ(規(guī)格：100 mg，北京拜爾迪生物公司，純度≥98%，-20℃保存)，大鼠微量白蛋白(mALB)、TGF-β1酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海滬尚生物有限公司，批號：201501)，超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(武漢博士德工程有限公司，批號：20150121)。VEGF(Ⅰ抗，Abcam，批號：20150101)，兔多克隆抗體(Ⅰ抗，Abcam，批號：20150302)，PM2235萊卡組織切片機(jī)、EG1150H萊卡包埋機(jī)(萊卡公司)，MULTISKANMK3全自動多功能酶標(biāo)儀(芬蘭)，WD-9413B凝膠成像系統(tǒng)DYY-6D型電泳儀電源、DYCZ-24DN型迷你垂直電泳儀和DYCP-40D型電轉(zhuǎn)儀(北京六一廠)。

1.3動物模型及分組 將50只Wistar大鼠適應(yīng)實驗室1 w后，禁食不禁水12 h，大鼠腹注1% STZ檸檬酸溶液50 mg/kg，72 h后采尾靜脈血，空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖≥〔5〕為造模成功。將造模成功的40只Wistar大鼠按體重分為模型組14只，薩麗嘎日迪低劑量組13只、高劑量組13只。另取20只Wistar正常大鼠，按體重分為空白組10只、空白給藥組(空白組+薩麗嘎日迪高劑量組)10只，空白組和模型組灌胃同等體積蒸餾水。薩麗嘎日迪低、高劑量組分別以100 mg·kg-1·d-1和220 mg·kg-1·d-1，每日1次灌胃薩麗嘎日迪?？瞻捉M灌胃同等體積的蒸餾水，空白給藥組(空白組+薩麗嘎日迪高劑量組)以220 mg·kg-1·d-1每日1次灌胃薩麗嘎日迪，灌胃體積為10 ml/kg，連續(xù)灌胃84 d。實驗期間大鼠共死亡11只，剩49只，空白組9只，模型組11只，薩麗嘎日迪低、高劑量組分別10只和11只，空白給藥組8只。

1.4指標(biāo)測定 最后一次給藥后禁食不禁水12 h，用代謝籠收集24 h尿液，-80℃保存；腹腔注射水合氯醛0.03 ml/kg麻醉，從腹主動脈取血，以3 000 r/min，離心10 min，取血清，-80℃保存，用ELISA檢測尿液mALB含量和血清TGF-β1含量；取左側(cè)腎臟，用濾紙吸干腎表面血液，置于10%甲醛溶液固定，脫水脫蠟，包埋，制作4 μm厚石蠟切片，做腎組織HE及PAS染色；取右側(cè)腎臟，-80℃保存，采用Western印跡檢測VEGF蛋白的表達(dá)。操作步驟：稱取右側(cè)腎臟，按總蛋白提取試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒說明書，提取蛋白并定量，SDS聚丙烯酰胺凝膠上分離，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加抗VEGF單抗(1∶1 000，TBS稀釋)或β-actin單抗(1∶500，TBS稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗一抗3次，加二抗(1∶2 000，TBS稀釋)，TBST洗一抗3次，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，壓X感光膠片，曝光，顯影定影，采用X感光膠片用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進(jìn)行掃描，分析條帶中吸光度值，以目的蛋白VEGF和β-actin內(nèi)參照吸光度值的比值用于統(tǒng)計分析。

1.5統(tǒng)計方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠24 h尿mALB的比較 與空白組比較，模型組24h尿mALB明顯升高，與模型組比較，薩麗嘎日迪各組24 h尿mALB明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組血清TGF-β1的比較 與空白組比較，模型組血清TGF-β1明顯升高，與模型組比較，薩麗嘎日迪各組血清TGF-β1明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組24 h尿mALB、血清TGF-β1水平比較

與空白組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3各組腎組織病理變化 HE染色結(jié)果表明，空白組腎小球大小適中、結(jié)構(gòu)清晰，腎小管及間質(zhì)未見病理改變；模型組腎小球肥大，腎小球的細(xì)胞增生明顯，系膜基質(zhì)增生，系膜區(qū)擴(kuò)大，腎小管上皮細(xì)胞可見空泡變性，間質(zhì)可見水腫；與模型組比較，薩麗嘎日迪各組腎組織腎小球系膜基質(zhì)增生減少，見圖1。PAS 染色結(jié)果表明，空白組腎小球、腎小管及間質(zhì)未見病理改變；模型組腎小球肥大，腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞糖原顆粒變性明顯；各治療組腎小球基底膜、系膜均有不同程度增生，病變情況好于模型組，見圖2。

2.4各組大鼠腎組織VEGF蛋白表達(dá)的變化 與空白組VEGF蛋白表達(dá)(0.84±0.06)比較，模型組VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高(0.98±0.05)，與模型組比較，薩麗嘎日迪低、高劑量組及空白給藥組腎組織VEGF蛋白表達(dá)水平明顯下降(0.89±0.08、0.92±0.03、0.87±0.07)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖1 各組大鼠腎臟病理變化(HE，×200)

圖2 各組大鼠腎臟病理變化(PAS，×200)

A：空白組；B：模型組；C：薩麗嘎日迪高劑量組；D：薩麗嘎日迪低劑量組；E：空白給藥組圖3 各組大鼠腎組織VEGF蛋白表達(dá)的變化

3 討 論

DN是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是造成終末期腎病(ESRD)的最常見原因之一，有20%～40%的糖尿病患者最終會發(fā)展到DN階段〔6〕。由于其發(fā)病機(jī)制不明確，尚缺乏理想的治療方法。研究表明，早期DN的特征是尿液中白蛋白排泄率輕度增加，逐步進(jìn)展至大量白蛋白尿上升，最終發(fā)生腎衰竭〔7〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，除高血糖和脂質(zhì)代謝異常外，尚有免疫機(jī)制炎癥因子和血管新生等也參與了DN的發(fā)病〔1〕。 mALB是常用的腎小球濾過功能早期受損的一個敏感、可靠指標(biāo)，其可以反映腎小球的早期的輕微損害〔8，9〕。白蛋白分子是一種可以通過腎小球濾過膜的最小蛋白質(zhì)，通常濾過膜后幾乎被近曲小管全部吸收，因此正常機(jī)體的尿液中的排泄量微乎其微，但當(dāng)腎小球發(fā)生病變后，腎小球基底膜上的負(fù)電荷乙酰硫酸肝素等物質(zhì)的分泌會減少，破壞了濾過屏障，導(dǎo)致濾過量與腎小管吸收量間的平衡被打破，這樣就導(dǎo)致了尿液中的白蛋白排泄量升高。由此說明尿白蛋白的檢測是糖尿病患者腎功能損傷的早期診斷指標(biāo)之一，同時也是反映患者的腎功能損傷程度的重要監(jiān)測指標(biāo)〔10〕。mALB可作為目前糖尿病早期腎損傷優(yōu)選診斷指標(biāo)〔11〕。本研究表明，薩麗嘎日迪對糖尿病早期腎損傷大鼠24h尿mALB有降低作用，使腎組織腎小球系膜基質(zhì)增生減少，糖原顆粒聚集少。

TGF-β1是腎小球硬化及腎纖維化共同通路的主要介導(dǎo)因子，在所有的DN患者中均可見TGF-β1活化。TGF-β1可促進(jìn)腎臟固有細(xì)胞肥大，加速ECM分子合成，并還具有促纖維黏連蛋白(FN)、Ⅰ、Ⅳ膠原蛋白表達(dá)，促細(xì)胞基質(zhì)(ECM)集聚及纖維化的效用，其表達(dá)水平與DN患者腎纖維化程度有關(guān)〔12〕。本實驗說明薩麗嘎日迪對DN大鼠血清TGF-β1有抑制或降解作用。

VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性的絲裂原，已發(fā)現(xiàn)VEGF與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明，系膜區(qū)VEGF表達(dá)增加可促進(jìn)系膜區(qū)蛋白外滲，血管外基質(zhì)增加而導(dǎo)致系膜區(qū)體積增大。另外，VEGF也可引起內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)改變，通過影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞間轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)蛋白尿的形成〔13〕。給予 VEGF單克隆抗體或血管生成抑制劑可緩解實驗性糖尿病鼠腎高濾過、腎臟萎縮、腎重和白蛋白排泄，提示VEGF與DN階段的血管結(jié)構(gòu)改變，血管新生有關(guān)〔12〕。因此，抑制VEGF的過表達(dá)對延緩DN的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸有著重要的理論意義和臨床價值。本實驗表明，糖尿病腎損傷大鼠腎臟組織VEGF的表達(dá)明顯增多，薩麗嘎日迪可以有效降低DN大鼠腎組織VEGF的異常表達(dá)。