王 宇 馮世兵 宋素貞 王洪波

(北京市和平里醫(yī)院，北京 100013)

核轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)因子(Nrf)2通過介導(dǎo)Ⅱ相解毒酶和一系列抗氧化酶，如谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(GST)、血紅素氧合酶(HO)-1、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的表達(dá)，從而降低各種藥物、細(xì)菌、毒素及化學(xué)致癌物的肝毒性〔1～3〕，是肝臟防御氧化應(yīng)激的最重要調(diào)節(jié)因子。齊墩果酸是五環(huán)三萜類化合物，廣泛分布于自然界近200種植物中，生物活性較多〔4〕，試驗(yàn)證實(shí)具有保肝作用〔5〕。研究證明三萜類化合物對(duì)Nrf2有激活作用〔6〕。本研究通過檢測(cè)Nrf2在小鼠肝臟中表達(dá)水平，探討齊墩果酸抗纖維化作用分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 雌性昆明小鼠30只，野生型SPF級(jí)，體重20～25 g，在山東大學(xué)第二醫(yī)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。美國Abcam公司抗Nrf2兔抗鼠多克隆抗體(ab53019)、纖維連接蛋白(FN)，上?；蛴邢薰镜耐?鼠通用型二抗免疫組化試劑盒(GK500705)、日本Olympus公司全自動(dòng)生化分析儀等。

1.2動(dòng)物模型制備和分組方法 實(shí)驗(yàn)小鼠均飼養(yǎng)1 w，溫度、濕度等條件完全相同。適應(yīng)環(huán)境后隨機(jī)分為3組：A組(對(duì)照組)：10只；B組(模型組)：10只，每天應(yīng)用濃度50%乙醇灌胃1次，12 ml/kg(4.8 g/kg)；C組(治療組)：10只，乙醇灌胃方法同B組。齊墩果酸提前1天開始灌胃，1次/d，用量20 mg/kg。本實(shí)驗(yàn)獲我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3標(biāo)本采集 于12周末，天平稱重，小鼠均12 h禁食(不禁水)，給予水合氯醛麻醉(0.3 ml/100 g)腹腔注射，心臟穿刺方法取血，以3 000 r/min離心20 min(離心半徑：104 mm)留取血清，-80℃冰箱保存。肝臟標(biāo)本2/5部分以10%的甲醛溶液固定備用。3/5部分液氮快速冰凍后儲(chǔ)存于-80℃冰柜中，用于制備RNA懸液等。

1.4血清生化指標(biāo)的檢測(cè) 血清標(biāo)本送生化檢測(cè)中心，由專業(yè)實(shí)驗(yàn)員使用生化分析儀分別檢測(cè)小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)和總膽紅素(TBIL)水平。

1.5病理學(xué)檢查 肝組織常規(guī)固定、石蠟包埋、切片(厚度約3.5 μm)。小鼠均制作3～5張肝臟標(biāo)本的組織切片，顯微鏡下根據(jù)HE及MT染色不同，選擇不同的放大倍數(shù)，每片拍攝5個(gè)不互相重疊的視野。慢性肝損害評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Thompson分級(jí)，在低倍鏡下(×100)觀察肝細(xì)胞炎癥及壞死情況。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，炎癥情況：無炎癥細(xì)胞浸潤為0分，炎細(xì)胞稀疏分布在壞死區(qū)域連接處為1分，炎細(xì)胞常見為2分，中性粒細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)為3分，淋巴細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)為4分。肝細(xì)胞損害情況：無肝細(xì)胞壞死為0分，以局灶性肝細(xì)胞壞死為主為1分，肝細(xì)胞呈現(xiàn)區(qū)域性壞死為2分，連續(xù)細(xì)條形或呈補(bǔ)丁樣壞死為3分，大片樣或融合的區(qū)域性肝細(xì)胞壞死為4分。采用盲法獨(dú)立閱片由2名熟練病理學(xué)教授完成，取平均值。

1.6肝組織細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(FN)沉積情況。FN應(yīng)用SP方法做免疫組織化學(xué)染色。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃棕色顆粒判定標(biāo)準(zhǔn)為陽性結(jié)果。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)(HPIAS)進(jìn)行分析(每片隨機(jī)選擇不相重疊5個(gè)高倍視野)。

1.7Nrf2的檢測(cè) 連續(xù)切片法將固定好的肝組織包埋后做4 μm組織切片，免疫組化采用EnVision染色法，PBS替代一抗作陰性對(duì)照，稀釋濃度為1∶300，已知陽性片作陽性對(duì)照。肝細(xì)胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕色顆粒結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為陽性，每張組織切片隨機(jī)選擇5個(gè)不相重疊高倍鏡視野，選 5個(gè)高倍視野計(jì)算陽性百分比的平均數(shù)。病理組織切片染色結(jié)果判定及閱片方法同上。

1.8數(shù)據(jù)處理 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、ANOVA單因素方差分析、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組ALT、AST、TBIL水平比較 B組ALT、AST、TBIL均顯著高于A組(P<0.05)，C組ALT、AST、TBIL均顯著低于B組(P<0.05)。見表1。

表1 ALT、AST、TBIL水平及Nrf2 表達(dá)情況

與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05，下表同

2.2各組HE染色結(jié)果比較 A組肝細(xì)胞形態(tài)、小葉結(jié)構(gòu)和匯管區(qū)均未見異常。B組：肝臟小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤以淋巴細(xì)胞為主，偶見少量中性粒細(xì)胞浸潤。肝細(xì)胞見散在的多發(fā)灶狀甚至結(jié)節(jié)樣壞死，變性嚴(yán)重。C組較B組組織學(xué)情況明顯改善。見表2、表3、圖1。

表3 各組肝細(xì)胞損傷比較(n=10，n)

2.3肝臟組織MT染色結(jié)果 A組肝臟組織纖維化(藍(lán)色)極輕，僅有少量，位于血管周圍。C組及B組纖維化范圍形態(tài)學(xué)測(cè)量分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義〔(1.86±1.23)%vs(3.55±1.37)%，P<0.05〕。B組纖維化范圍形態(tài)學(xué)測(cè)量分析較A組(0.03±0.02)%顯著增加(P<0.05)。B組肝組織見較多增寬的纖維組織分割并且相互連接，位于匯管區(qū)及中央靜脈周圍。C組纖維化分隔纖細(xì)，范圍較B組明顯減小，見圖2。

圖1 肝組織炎癥情況(HE，×200)

2.4FN免疫組化染色 A組極少量FN表達(dá)〔(0.05±0.03)%〕。B組FN表達(dá)較A組明顯增強(qiáng)(P<0.05)。C組與B組FN表達(dá)差異顯著〔(2.32±1.13)% vs (5.17±2.05)%，P<0.05〕。見圖3。

2.5Nrf2表達(dá)情況 B組較A組Nrf2表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，而C組明顯強(qiáng)于B組(P<0.05)。見表1及圖4。

圖2 肝組織纖維化情況(MT，×100)

圖3 肝組織FN表達(dá)情況(DAB，×100)

圖4 肝組織Nrf2表達(dá)(DAB，×400)

3 討 論

酒精性肝病是臨床常見病，傳統(tǒng)分為酒精性脂肪肝、肝纖維化、酒精性肝炎、肝硬化。本研究通過酒精灌胃方法模擬飲酒，利用乙醇引發(fā)氧化應(yīng)激原理，12 w后成功構(gòu)建了昆明小鼠肝纖維化模型。乙醇誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激機(jī)制是其在代謝過程中干擾能量代謝(線粒體三羧酸循環(huán)及脂肪酸代謝)，產(chǎn)生大量活性氧自由基(ROS)、細(xì)胞色素酶P450(CYP2E1)誘導(dǎo)產(chǎn)生的羥乙基自由基(HER)、耗竭還原性谷胱甘肽繼發(fā)抗氧化屏障損傷及耗竭Kuffper 細(xì)胞共同作用結(jié)果〔7〕。氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致線粒體膜的通透性增加，肝細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子(TNF)-α的敏感性增加，從而促進(jìn)肝細(xì)胞發(fā)生壞死或凋亡。ROS尚可引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，組織蛋白變性和DNA的損傷。肝星形細(xì)胞(HSC)的激活引發(fā)了促纖維化因子的釋放及膠原合成基因的表達(dá)，脂質(zhì)過氧化物及HER繼發(fā)各種免疫異常，導(dǎo)致肝組織慢性炎癥“永久化”，最終發(fā)生肝纖維化〔8〕。Nrf2屬于b-ZIP家族，是調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子。Nrf2調(diào)節(jié)肝內(nèi)諸多細(xì)胞抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶等基因的基礎(chǔ)表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)，生理狀態(tài)下與胞質(zhì)中的抑制因子Keap1結(jié)合處于抑制狀態(tài)。Keap1在C273等部位存在巰基，氧化應(yīng)激導(dǎo)致其失去電子，形成二硫鍵，從而構(gòu)型發(fā)生改變，Nrf2與Keap1解耦聯(lián)后轉(zhuǎn)移入核與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)下游的抗氧化酶基因及Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，包括GST、HO-1、SOD、CAT，醌氧化還原酶(Nqo)1等，增加細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的能力〔9〕。同野生鼠(Nrf2+)相比，Nrf2基因敲除小鼠(Nrf2-)對(duì)四氯化碳損害修復(fù)延遲，炎癥反應(yīng)及纖維化程度明顯增強(qiáng)〔10〕，對(duì)乙酰氨基酚引起的肝損傷較敏感，脂質(zhì)過氧化和DNA損傷增加，肝細(xì)胞壞死程度和乙酰氨基酚毒性反應(yīng)均增加〔11〕；肝臟切除后的肝細(xì)胞增生延遲，凋亡增加〔12〕。作為引起肝細(xì)胞損傷最常見的氧化應(yīng)激因素的乙醇能誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)。Lamle等〔13〕研究表明這是肝細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激一種適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)。齊墩果酸能顯著促進(jìn)酒精灌胃小鼠肝細(xì)胞Nrf2基因表達(dá)，推測(cè)在與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的肝纖維中，齊墩果酸保護(hù)肝細(xì)胞作用機(jī)制是通過增強(qiáng)Nrf2表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。研究表明三萜類化合物可作為Nrf2基因的特別誘導(dǎo)劑，其通過激活Nrf2抑制黃曲霉毒素誘導(dǎo)的肝臟癌變過程〔14，15〕。CDDO-IM是一種人工合成三萜類化合物，能顯著降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)水平及死亡率，具體機(jī)制與激活Nrf2途徑有關(guān)。CDDO-IM預(yù)處理小鼠能通過誘導(dǎo)Nrf2及下游的抗氧化基因表達(dá)減輕乙酰醋氨酚導(dǎo)致的各種肝損害〔6〕。

乙醇代謝過程中產(chǎn)生了大量的ROS及HER，導(dǎo)致肝組織大量炎細(xì)胞浸潤及促炎因子產(chǎn)生，HSC被激活轉(zhuǎn)化，合成大量FN；細(xì)胞外基質(zhì)在竇周間隙的大量沉積導(dǎo)致纖維化發(fā)生。本研究證實(shí)，齊墩果酸能顯著降低酒精灌胃小鼠的血清ALT、AST、TBIL水平，減輕肝細(xì)胞的炎癥損傷和肝組織纖維化過程。其抗纖維化分子機(jī)制可能是通過增強(qiáng)Nrf2的表達(dá)，加強(qiáng)Ⅱ相解毒酶和各種抗氧化基因表達(dá)，減弱氧化應(yīng)激，減少炎細(xì)胞浸潤，阻止HSC的激活，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成并增加降解，減少細(xì)胞外基質(zhì)(例如FN)的產(chǎn)生和蓄積而實(shí)現(xiàn)的。Nrf2對(duì)肝細(xì)胞增殖與凋亡、信號(hào)傳導(dǎo)通路及活化等作用機(jī)制是未來研究的方向。齊墩果酸有效成分(三萜類化合物)提純，人工合成及改良研究也是未來研究方向。