董合玲 譚慶麟 葉志彬 葉兆康 盧志斌 李 浩 張漢文 吳 敏 吳依芬

(暨南大學(xué)體育學(xué)院，廣東 廣州 510632)

乳腺癌位于女性癌癥之首〔1，2〕。乳腺癌發(fā)展到一定階段后，會有不同程度的轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)是癌腫經(jīng)過直接浸潤蔓延或淋巴管、血管等途徑轉(zhuǎn)移至其他器官并繼續(xù)增殖生長，形成與原發(fā)瘤同樣性質(zhì)的癌腫。MBC患者治療后生存時間較長，因此MBC患者的治療至關(guān)重要。三苯氧胺(他莫昔芬，TAM)是最基本的內(nèi)分泌治療藥物，但TAM治療過程中，除了原發(fā)耐藥(TAM-R)之外〔3〕，約30%最終產(chǎn)生繼發(fā)耐藥〔4〕，導(dǎo)致治療失敗，治療失敗后采取化療副作用大，過程痛苦。因此，探索乳腺癌內(nèi)分泌耐藥的機制，尋找抑制內(nèi)分泌耐藥的有效藥物是迫切需要解決的問題。本文研究補中益氣湯逆轉(zhuǎn)TAM-R而抑制乳腺癌細(xì)胞生長的機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 MCF-7細(xì)胞(人乳腺癌細(xì)胞系，美國ATCC株亞型)；二甲基亞砜(DMSO)、焦碳酸二乙酯(DEPC，美國Sigma公司)；4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，MBCHEM公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；TAM(Hoffman-La Roche公司)；補中益氣湯(根據(jù)《中華人民共和國藥典》制備)；引物合成(美國Invitrogen公司)；放射免疫沉淀實驗(RIPA)裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；SYBR premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa公司)。

1.2實驗方法 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞鋪滿皿底面積的90%以上時，取生長狀態(tài)好的細(xì)胞傳代。正式實驗時，細(xì)胞平均種于35 cm六孔板中，以減少組間差異。實驗分5組，分別為MCF-7、MCF-7+TAM、MCF-7+補中益氣湯、MCF-7/TAM-R、MCF-7/TAM-R+補中益氣湯。TAM用量為5 μg/ml，TAM培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)6個月以上，即誘導(dǎo)產(chǎn)生耐TAM人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/TAM-R。補中益氣湯用量為1.5 μg/μl。

1.3MTT檢測細(xì)胞存活率 各組細(xì)胞貼壁后，根據(jù)分組藥物處理18 h，倒置顯微鏡下觀察。然后加入5 mg/ml濃度的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。反應(yīng)末，去除培養(yǎng)基加入150 μl的DMSO低速振蕩10 min后酶標(biāo)儀測量吸光度。根據(jù)公式計算結(jié)果，進(jìn)而評價各組細(xì)胞的存活率。

1.4Western印跡檢測雌激素受體(ER)、血管內(nèi)皮生長因子受體(EGFR)、人表皮生長因子受體(HER)-2、Akt蛋白含量 各組細(xì)胞加入200 μl蛋白裂解液〔50 mmol/L Tris-HCl pH8.0，150 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，1 mmol/L二硫代蘇糖醇(DTT)，0.1%十二烷基磺酸鈉(SDS)，25 mmol/L NaF，0.1 mmol/L Na3VO4，100 mg/L苯甲基硫酸氟(PMSF)，2 μg/ml亮抑酶肽，1 μg/ml抑肽酶〕，冰上裂解15 min后收樣，分裝保存在-80℃。Bio-Rad 測定提取上清液中的蛋白質(zhì)濃度，加上樣緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH6.8，2% SDS，10%丙三醇，2%β-巰基乙醇和0.5‰溴酚藍(lán))，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，1×三羥甲基氨基甲烷(TBS)液洗滌3次，加入二抗，37℃孵育，1×TBS液洗滌3次。電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯色，KODAK Image Station 4000MM 圖像系統(tǒng)曝光，分析讀取條帶面積，寬度和灰度值。

1.5qRT-PCR檢測ER、EGFR、HER-2、Akt的mRNA表達(dá) “Primer-Premier 5”軟件設(shè)計引物。Trizol 試劑盒提取各組細(xì)胞的總mRNA，溶于適量DEPC水后分裝，取適量測其純度和總量，其余于-80℃冰箱保存。使用反轉(zhuǎn)錄儀將RT反應(yīng)液中的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件：37℃15 min；85℃5 s；4℃30 min。將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA于-80℃冰箱保存。PCR操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)液混勻后在熒光PCR儀上擴增目的基因：95℃預(yù)變性30 s一個循環(huán)，然后執(zhí)行(95℃變性5 s，60℃退火25 s，72℃延伸30 s)45個循環(huán)，最后72℃再延伸5 min，反應(yīng)結(jié)束后，采用55～95℃間隔1℃ 2 s進(jìn)行融解曲線分析。

1.6統(tǒng)計處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1補中益氣湯干預(yù)MCF-7/TAM-R細(xì)胞存活率 MCF+TAM組和MCF+補中益氣湯組細(xì)胞存活率〔(51.1±0.79)%、(59.2±0.28)%〕較MCF-7組〔(83.3±0.62)%〕顯著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R組細(xì)胞存活率〔(82.7±0.53)%〕與MCF-7組無顯著差異。MCF-7/TAM-R補中益氣湯組細(xì)胞存活率〔(44.5±0.36)%〕顯著下降(P<0.05)。

2.2補中益氣湯干預(yù)MCF-7/TAM-R細(xì)胞后蛋白量 MCF-7+TAM組和MCF-7+補中益氣湯組ER、EGFR、HER-2及下游Akt的蛋白量較MCF-7組顯著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R組與MCF-7組相比，HER-2、Akt、EGFR和ER蛋白量有所上升，無顯著差異。MCF-7/TAM-R+補中益氣湯組ER、EGFR、HER-2及下游Akt的蛋白量均下降。見圖1和表1。

圖1 補中益氣湯干預(yù)MCF-7/TAM-R細(xì)胞機制蛋白表達(dá)

表1 補中益氣湯干預(yù)MCF-7/TAM-R細(xì)胞機制蛋白表達(dá)

與MCF-7組相比:1)P<0.05，下表同

2.3中益氣湯干預(yù)MCF-7/TAM-R細(xì)胞后基因表達(dá)變化 MCF-7+TAM組和MCF-7+補中益氣湯組ER、EGFR、HER-2及下游Akt mRNA表達(dá)較MCF-7組顯著下降(P<0.05)。MCF-7/TAM-R組與MCF-7組相比，HER-2和Akt mRNA有所上升，EGFR和ER mRNA表達(dá)下降均無顯著差異。MCF-7/TAM-R+補中益氣湯組ER、EGFR、HER-2及Akt mRNA表達(dá)均顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 補中益氣湯干預(yù)MCF-7/TAM-R細(xì)胞基因表達(dá)

3 討 論

乳腺癌發(fā)展到一定階段后進(jìn)展為MBC。但是，TAM治療過程中，除了原發(fā)耐藥之外〔3〕，約30%最終產(chǎn)生繼發(fā)耐藥〔4〕，導(dǎo)致治療失敗。大量臨床研究表明，ER失調(diào)和過表達(dá)EGFR/HER-2是造成TAM-R的重要機制〔5～7〕；PI3K/AKT/mTOR通路是在ER交互作用中的重要通路，抑制Akt可以抑制ER和EGFR/HER-2的交互作用〔8～10〕。

乳腺癌的治療包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、化療放療、運動療法、中醫(yī)療法、分子靶向治療等〔11，12〕。中藥療法或運動干預(yù)與分子靶向治療的有機結(jié)合可提高腫瘤的治療效果〔13～16〕。中醫(yī)對于治療乳腺癌的病理機制及發(fā)展過程早有記載。補中益氣湯是“益氣升陽”的代表方，方中重用黃芪，配伍人參、炙甘草、白術(shù)等諸藥，功用補益脾氣、升陽舉陷、甘溫除熱，使元氣充盛，清陽上升，是臨床上治療脾胃氣虛證的一條有效處方。

補中益氣湯通過下調(diào)ER、EGFR、HER-2及下游Akt mRNA表達(dá)及蛋白含量，而逆轉(zhuǎn)了MCF-7細(xì)胞對TAM耐藥，從而進(jìn)一步促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的凋亡，達(dá)到控制乳腺癌的效果。