盧杰，鄧珊珊，姜世君，江榮科（.大慶醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，黑龍江大慶633；.大慶龍南醫(yī)院，黑龍江大慶633）

早期發(fā)現(xiàn)癌癥，篩查非常重要，但傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物缺少所需靈敏度。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，存活素（Survivin）主要分布于大多數(shù)常見(jiàn)腫瘤組織內(nèi)，在腫瘤的診斷中具有重要作用。Survivin蛋白有2種具有不同抗凋亡特性的新的Survivin剪接變異體，一種是缺乏外顯子3的Survivin-△EX3；一種是保留了部分內(nèi)含子2作為隱性外顯子的Survivin-2B。通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)研究2種剪接變異體對(duì)凋亡的調(diào)控發(fā)現(xiàn)，Survivin-△EX3保留了抗凋亡特性，而Survivin-2B的抗凋亡能力明顯降低。Survivin可用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)，qRT-PCR采用獨(dú)特封閉反應(yīng)，減少了污染，可靠性高，且操作時(shí)間短。本研究應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)了肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌患者外周血Survivin及其剪接變異體——Survivin-△EX3、Survivin-2B mRNA表達(dá)量及檢出率，探討了作為腫瘤標(biāo)志物的外周血Survivin及其剪接變異體診斷早期癌癥是否更為靈敏，旨在為進(jìn)一步早期癌癥的篩查提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器 總RNA抽提試劑購(gòu)自美國(guó)Invtrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA分子標(biāo)準(zhǔn)2000均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，RNA抑制劑、6×上樣緩沖液均購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司，熒光核酸凝膠染料購(gòu)自美國(guó)Biotium公司，超純水購(gòu)自韓國(guó)BIONEER公司，qRTPCR 8聯(lián)管購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，PCR引物由北京擎科生物工程有限公司合成，2720型PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，四通道qRT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2013—2015年采集大慶龍南醫(yī)院新入院且未進(jìn)行放、化療或手術(shù)治療的90例腫瘤患者靜脈血，以乙二胺四乙酸二鉀抗凝管采集抗凝血，其中乳腺癌患者22例，肺癌患者23例，結(jié)直腸癌患者23例，胃癌患者22例。另采集30例職工體檢者靜脈血作為對(duì)照組。90例腫瘤患者均經(jīng)病理類(lèi)型組織細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)、臨床表現(xiàn)等確診。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer premier5.0軟件設(shè)計(jì)并合成特異性引物。見(jiàn)表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.2.3 RNA提取 采用通用型RNA快速提取試劑盒，提取樣品RNA，最后加入30.00μL無(wú)RNase的水，溶解RNA。

1.2.4 DNase I消化樣品RNA中DNA 10μg RNA模板、4.00μL核糖核酸酶抑制劑、10.00μL脫氧核糖核酸酶Ⅰ緩沖液、10.00μL脫氧核糖核酸酶Ⅰ、焦碳酸二乙酯處理水至 100.00μL，混勻37℃90 min。取各個(gè)RNA樣品4.00μL，瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠紫外分析儀觀(guān)察，照相保存。

1.2.5 RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的具體操作：3μg RNA 模板、4.00μL引物（50μmol/L）、焦碳酸二乙酯處理水至25.00μL，混勻70℃5 min，立即冰浴。8.00μL 6×上樣緩沖液、4.00μL脫氧核糖核苷三磷酸 10 mmol/L、1.00 μL RNase Inhibitor，混勻 37 ℃5 min，加入2.00μL反轉(zhuǎn)錄酶，42℃保溫60 min，于70℃溫育10 min，結(jié)束反應(yīng)，置冰上保存，以備PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 PCR檢測(cè) 取0.2 mL薄壁PCR管，分別編號(hào)。向各管中加入含染料2×PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液10.00μL，10 mol/L各基因引物混合物1.00μL，對(duì)應(yīng)的cDNA各2.00μL，其中1管不加模板作為陰性對(duì)照，各管補(bǔ)加水至20.00μL，混勻后置于PCR儀中95℃預(yù)變性5 min，95℃15 s→65℃30 s，40個(gè)循環(huán)；120 V電壓下電泳20 min，電泳結(jié)束后采用凝膠紫外分析儀照相保存。

1.2.7 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 取0.2 mL薄壁PCR管，分別編號(hào)，加入1.00μL cDNA模板、0.50μL 10 mmol/L引物、12.50μL 2×PCR擴(kuò)增預(yù)混和溶液、1.25μL實(shí)時(shí)定量PCR DNA結(jié)合染料，用雙蒸水補(bǔ)至25.00μL，混勻，置于qRT-PCR儀中。95℃預(yù)變性5 min后，95℃15 s→65℃30 s（熒光檢測(cè)），40個(gè)循環(huán)。溶解曲線(xiàn)65～95℃。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、LSD-t檢驗(yàn)等；正態(tài)分布資料采用直條圖描述，非正態(tài)分布資料采用箱式圖。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA提取結(jié)果 各組研究對(duì)象提取的總RNA經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定為6.8～22.7μg/mL，A260/A280比值為1.8～2.1，說(shuō)明提取的RNA濃度適當(dāng)，純度高。RNA提取物于1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果每條泳道對(duì)應(yīng)都有3條亮帶，從上至下依次為28、18、5 S，說(shuō)明RNA產(chǎn)物完整性較好。不同癌種RNA電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 不同癌種RNA電泳圖

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板擴(kuò)增目的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，大小與目的片段一致，條帶清晰，無(wú)引物二聚體，能滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖2。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 qRT-PCR結(jié)果

2.3.1 擴(kuò)增曲線(xiàn)及溶解曲線(xiàn) 擴(kuò)增曲線(xiàn)基線(xiàn)平直，各管平行性良好，擴(kuò)增效率相近。溶解曲線(xiàn)峰值較高，尖峰，且無(wú)雜峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性高，擴(kuò)增體系良好。見(jiàn)圖3。

2.3.2 各組研究對(duì)象 Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相對(duì)表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌Survivin mRNA、Survivin-△Ex3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，Survivin-2B mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖 4～6。

圖3 擴(kuò)增曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)

表2 各組研究對(duì)象Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表2 各組研究對(duì)象Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05

檢測(cè)項(xiàng)目Survivin Survivin-2B Survivin-△Ex3胃癌（n=22）1.850±0.402a 0.061±0.052a 0.911±0.110a對(duì)照組（n=30）0.025±0.007 0.840±0.141 0.026±0.005肺癌（n=23）1.771±0.140a 0.139±0.040a 1.478±0.202a乳腺癌（n=22）1.551±0.071a 0.201±0.041a 1.771±0.091a結(jié)直腸癌（n=23）1.849±0.611a 0.072±0.048a 1.331±0.051a

2.3.3 不同癌種患者外周血 Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3檢出率比較 不同癌種患者外周血Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3 檢出率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

圖4 各組研究對(duì)象Survivin相對(duì)表達(dá)量比較

圖5 各組研究對(duì)象Survivin-2B相對(duì)表達(dá)量比較

圖6 各組研究對(duì)象Survivin-△Ex3相對(duì)表達(dá)量比較

表3 不同癌種患者外周血Survivin、Survivin-2B、Survivin-△Ex3檢出率比較[n（%）]

3 討 論

腫瘤是一種多基因疾病，目前，已發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)基因達(dá)500種以上，腫瘤病因的復(fù)雜性和多樣性決定了腫瘤研究工作的艱巨性。腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是降低死亡率，改善患者預(yù)后的關(guān)鍵所在。

腫瘤標(biāo)志物是由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生的或由機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在和生長(zhǎng)的一類(lèi)物質(zhì)[1]。外周血腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)傷、可重復(fù)、可于同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行多項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是腫瘤診斷和隨訪(fǎng)的理想手段[2]。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的最新成員，是1997年耶魯大學(xué)GARZON等[3]利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-1 cDNA在人類(lèi)基因組庫(kù)中篩選分離出來(lái)的，因其具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡功能，故被命名為“存活素或生存素”。

Survivin基因全長(zhǎng)14.7 kb，是迄今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白之一，有研究探討了Survivin在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，60種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞株均有Survivin的表達(dá)，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤等，其是人腫瘤細(xì)胞和正常組織細(xì)胞中表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)之一，這一特點(diǎn)可能使其成為腫瘤標(biāo)志物之一[4]。由于Survivin在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，其也可能成為腫瘤基因診治的理想靶點(diǎn)[5]。

魏霞等[6]采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測(cè)了活檢組織Survivin mRNA的表達(dá)，46例肺癌組患者Survivin mRNA表達(dá)明顯高于17例肺部良性疾病組。一項(xiàng)非小細(xì)胞肺癌的研究表明，患者體內(nèi)Survivn表達(dá)率達(dá)85.0%[7]。Survivin基因可能為肺癌的診斷提供了新的方法[8]。王彬等[9]采集50例接受手術(shù)的胃癌患者癌變組織，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Survivin mRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌患者Survivin mRNA表達(dá)陽(yáng)性率高達(dá)68.0%，提示Survivin或許可以作為胃癌早期診斷的重要分子標(biāo)志物。王波[10]采集50例胃癌患者、20例胃良性病變患者及35例健康者外周血，采用RT-PCR檢測(cè)Survivn mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，胃癌患者外周血Survivn mRNA表達(dá)量明顯高于健康者及胃良性病變患者。李昌榮等[11]認(rèn)為，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)外周血Survivin基因表達(dá)，可能是一種較理想的無(wú)創(chuàng)性早期診斷、評(píng)估胃癌患者預(yù)后的有效指標(biāo)，有助于延長(zhǎng)胃癌患者生存時(shí)間及改善其生活質(zhì)量。有研究表明，肝細(xì)胞癌組織Survivin mRNA表達(dá)量明顯高于其相應(yīng)的癌旁組織及正常肝臟組織[12]。施朕善等[13]研究了116例結(jié)直腸癌患者，Survivin mRNA表達(dá)陽(yáng)性率為76.7%。邢春瑤等[14]在42例宮頸癌患者的病變組織中檢測(cè)出Survivin表達(dá)陽(yáng)性率為100.0%，在乳腺癌中Survivin表達(dá)陽(yáng)性率為70.0%。JHA等[15]通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高達(dá)93.6%的乳腺癌患者Survivin高表達(dá)。張香連[16]研究表明，Survivin在乳腺癌患者外周血中表達(dá)水平明顯高于乳腺良性腫瘤患者和健康婦女，提示Survivin是診斷乳腺癌的良好腫瘤標(biāo)志物。

目前已發(fā)現(xiàn)，人Survivin通過(guò)不同的選擇性剪接形成5種剪接變異體，編碼5種不同的蛋白質(zhì)，分別為Survivin、Survivin-2B、Survivin-3B、Survivin-△Ex3 和Survivin2α[17]。Survivin的不同亞型及不同的細(xì)胞定位可能導(dǎo)致其凋亡和抗凋亡之間的功能存在差異。Survivin-2B和Survivin-△Ex3在腫瘤的發(fā)展中顯示了不同的作用，存在著復(fù)雜的調(diào)節(jié)平衡，這種平衡的調(diào)節(jié)在腫瘤的形成中具有重要作用[18]。

國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道，Survivin-△Ex3主要表達(dá)于惡性腫瘤，而Survivin-2B主要表達(dá)于良性腫瘤。張恩等[19]采用PCR對(duì)52例胃腸道腫瘤患者外周血Survivin-△Ex3 mRNA表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，腫瘤患者Survivin-△Ex3 mRNA表達(dá)高于對(duì)照組。另外，Survivin不同剪接變異體與腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系也很復(fù)雜，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在非小細(xì)胞肺癌患者中，Survivin-2B相對(duì)于Survivin-△Ex3的大量表達(dá)與Survivin-△Ex3相對(duì)于Survivin-2B的大量表達(dá)來(lái)說(shuō)具有更好的預(yù)后[20]。

本研究通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)了90例不同癌種患者和30例健康體檢者外周血Survivin及其剪接變異體的表達(dá)，其中擴(kuò)增結(jié)直腸癌標(biāo)本23例，胃癌標(biāo)本22例，乳腺癌標(biāo)本22例，肺癌標(biāo)本23例，結(jié)果顯示，腫瘤患者Survivin、Survivin-△Ex3較對(duì)照組顯著高表達(dá)，而Survivin-2B較對(duì)照組顯著低表達(dá)。

有研究表明，在不同癌種患者中Survivin及其剪接變異體——Survivin-2B、Survivin-△Ex3表達(dá)是不同的，目前，腫瘤檢測(cè)研究大多針對(duì)活體組織，創(chuàng)傷大，通過(guò)靜脈采血的方式檢測(cè)外周血Survivin及其剪接變異體——Survivin-2B、Survivin-△Ex3的表達(dá)，且通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，Survivin作為腫瘤標(biāo)志物與肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌常用的標(biāo)志物比較，靈敏度較高。這種無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單檢查的高靈敏度非常適合具有高復(fù)發(fā)率的腫瘤疾病，使Survivin及其剪接變異體可能成為檢測(cè)腫瘤的標(biāo)志物之一，也可作為腫瘤標(biāo)記分子及預(yù)后的檢測(cè)指標(biāo)應(yīng)用于臨床，具有良好的研究及應(yīng)用前景。