張錄民 姚健 陳玲玲

近年來(lái)，肺癌發(fā)生率呈逐年增加趨勢(shì)，并呈逐漸年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重影響著人類(lèi)的健康和生活質(zhì)量[1]?；熓悄壳芭R床治療中晚期肺癌的主要手段，尤其是隨著化療藥物增加，各種藥物不斷面市，抗癌作用明顯增強(qiáng)，越來(lái)越多的研究加以肯定，但仍未能解決化療藥物的抗癌問(wèn)題[2-3]。有資料[4]報(bào)道，腫瘤相關(guān)抗原MUCI是一種高度糖基化的1型膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白，在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中均有參與。本文就探討MUC1蛋白核心的重復(fù)序列IgG3單克隆抗體（C595）對(duì)人肺癌A549的影響。

1 資料與方法

1.1 材料

于2018年1—5月行此次檢測(cè)試驗(yàn)，于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供的人肺癌A549細(xì)胞株，日本同仁化學(xué)研究所提供的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8。單克隆抗體C595由英國(guó)諾丁漢大學(xué)提供，非特異性同型對(duì)照單克隆抗體IgG1由澳大利亞新南威爾士大學(xué)提供。武漢博士德生物工程公司提供的ABC免疫組化試劑盒；美國(guó)Mefck chemicals公司提供的細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)（TUNEL），美國(guó)RD Systems公司提供的酶聯(lián)免疫吸附劑（ELISA）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取10％胎牛血清的AMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行人肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，維持37℃環(huán)境、5％CO2及飽和濕度環(huán)境內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞株培養(yǎng)與傳代，每2～3 d對(duì)其進(jìn)行一次換液傳代，以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 MUC1表達(dá)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)549細(xì)胞及細(xì)胞/孔接種于24孔板內(nèi)生長(zhǎng)培養(yǎng)24 h，細(xì)胞完全貼壁，取出蓋玻片，以TBS輕洗，冰甲醇溶液室溫固定10 min，TBS漂洗后，在室溫下滴加C595單克隆抗體保持1 h，再取二抗Alexa羊抗鼠488抗體室溫下孵育1 h，TBS漂洗，用P1溶液染色1 h，鏡下檢測(cè)觀(guān)察。采取間免疫熒光法檢測(cè)，0.25％胰蛋白酶消化A549細(xì)胞株，制成單細(xì)胞懸液，用含有5％胎牛血清PBS洗滌，離心5 min，1 000 r/min，丟棄上清液，滴加32 μg/ml C595孵育。PBS洗滌，加入5％胎牛血清。流式細(xì)胞儀檢測(cè)前加入碘化丙啶。

1.4 細(xì)胞增殖

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A(yíng)549細(xì)胞，放置200 μl/孔接種于96孔板內(nèi)，在37℃、5％CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，取出培養(yǎng)板，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組：加入等體積培養(yǎng)液；觀(guān)察組：培養(yǎng)板內(nèi)加入最終度5、25、50、75、100 μg/ml單抗C595，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液為凋零組。加入MTT20 μl繼續(xù)培養(yǎng)，離心丟棄上清液，加入100 μl DMSO，充分振蕩混勻，在酶標(biāo)儀上加入562 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

采取TUNEL法檢測(cè)，取12孔板、2×105個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞孔進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24h，隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組：加入等體積培養(yǎng)液；觀(guān)察組：加入IC50單抗C595；培養(yǎng)48 h，收集漂浮細(xì)胞以及貼壁細(xì)胞，在經(jīng)PBS洗滌后，制備成細(xì)胞懸液，制作成細(xì)胞甩片，在2％多聚甲醛室溫保持20min，按照說(shuō)明書(shū)操作。陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照切片，陰性對(duì)照：TBS代替TDT反應(yīng)液。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用％表示。

2 結(jié)果

2.1 單抗C595標(biāo)記的MUC1在A(yíng)549細(xì)胞上的標(biāo)準(zhǔn)

顯微鏡下觀(guān)察單抗C595標(biāo)記的MUC1在A(yíng)549細(xì)胞上表達(dá)，具體見(jiàn)表1。

表1 兩組單抗C595標(biāo)記的MUC1及其表達(dá)量

2.2 C595對(duì)A549細(xì)胞株增殖的影響

C595濃度增加，A549細(xì)胞株增殖抑制效果越強(qiáng)，凋亡率增加，存活率降低，經(jīng)48 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算：C595作用A549細(xì)胞為 38 μg/ml。

2.3 C595對(duì)A549細(xì)胞株凋亡的影響

通過(guò)TUNEL檢測(cè)法檢測(cè)，對(duì)A549細(xì)胞株采取40 μg/L單抗C595治療48 h，A549細(xì)胞核染色呈顯著棕黃色，多見(jiàn)陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)；對(duì)照組見(jiàn)細(xì)胞核染色不明顯，幾乎不存在染色細(xì)胞數(shù)；C595對(duì)人肺癌A549細(xì)胞株凋亡作用明顯。

3 討論

肺癌是目前危害人類(lèi)身心健康的首位惡性腫瘤，多數(shù)患者在確診后病情進(jìn)展至中晚期，進(jìn)而錯(cuò)失了手術(shù)最佳時(shí)機(jī)[5-6]。目前化療藥物的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，明顯改善了患者病情，但由于化療藥物耐藥性，使患者5年生存率降低。因此，選擇更為安全有效的化療藥物，提高患者5年生存率是臨床亟待解決的問(wèn)題。MUCI是一種高度糖基化的1型膜轉(zhuǎn)運(yùn)糖蛋白，通常分布在正常腺上皮細(xì)胞的頂端位置，在90％腺癌中過(guò)度表達(dá)[7]。C595屬于MUC1的IgG3單克隆抗體，是患者M(jìn)UC1的蛋白核心[8]。有相關(guān)研究資料[9]報(bào)道，在90％以上的晚期肺癌者中C595呈陽(yáng)性表達(dá)，在正常人體組織中并無(wú)C595表達(dá)。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞膜表面覆蓋有97.3％MUC1表達(dá)量，陰性對(duì)照組MUC1表達(dá)量為1.03％。因此單抗C549于A(yíng)549細(xì)胞膜表面生長(zhǎng)。在對(duì)肺癌A549細(xì)胞株作用發(fā)現(xiàn)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，不同濃度單抗C595對(duì)A549細(xì)胞增殖的抑制作用也不同。線(xiàn)粒體途徑是致細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制，細(xì)胞色素C于線(xiàn)粒體釋放到胞漿，在使用C595治療A549細(xì)胞株48h后，A549細(xì)胞數(shù)明顯凋亡[10]。單抗C595誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，主要是依靠是單抗C595能夠產(chǎn)生補(bǔ)體依賴(lài)的細(xì)胞毒性作用，以及抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的毒性作用，進(jìn)而促使肺癌細(xì)胞A549凋亡，并抑制其生長(zhǎng)[11-12]。總而言之，單克隆抗體C595在體外抑制人肺癌細(xì)胞A549生長(zhǎng)，若C595濃度增加，A549細(xì)胞存活率降低，凋亡率增加，而C595誘導(dǎo)A549凋亡的發(fā)病機(jī)制需進(jìn)一步明確。