李士慧，梁 婷，寇送波，信 悅，張 諾，王廣慧

(綏化學院食品與制藥工程學院，黑龍江綏化 152061)

杏鮑菇是一種深受人們喜愛的珍稀食用菌，兼具有食用及藥用價值[1-2]，具有十分廣闊的開發(fā)前景，但迄今為止，有關(guān)于杏鮑菇黃酮提取技術(shù)的研究并不是很多，且所獲得的黃酮提取率也很低[3]。本研究嘗試利用超聲波粉碎技術(shù)與復合酶解技術(shù)相結(jié)合的方法提取杏鮑菇黃酮，提取率達到了3.352%，以期為開發(fā)杏鮑菇黃酮資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇，綏化市大潤發(fā)超市；磷酸氫二鈉、檸檬酸、硝酸鋁、亞硝酸鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純，產(chǎn)自天津市津東天正精細化學試劑廠；木瓜蛋白酶和纖維素酶，武漢諾輝化工有限公司。

1.2 主要儀器

752型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；賽多利斯BSA224S型電子分析天平，德國賽多利斯公司；JY92-ⅡDN型超聲波細胞粉碎儀，寧波新芝生物科技公司。

1.3 方法

1.3.1測定方法 采用硝酸鋁—亞硝酸鈉法測定杏鮑菇中黃酮的含量。標準曲線的繪制及線性回歸方程的獲得方法參見文獻[4]。杏鮑菇黃酮提取率的計算方法如式(1)：

(1)

式(1)中，R——杏鮑菇黃酮提取率(%)；C1——提取液中黃酮含量(g)；C0——杏鮑菇原料質(zhì)量(g)。

1.3.2超聲波輔助復合酶法提取杏鮑菇黃酮的操作步驟[5-10]將杏鮑菇清洗干凈后切片，用烘箱在50℃下干燥至恒重，掰碎后放入高速萬能粉碎機中粉碎2 min，即制得杏鮑菇干粉。精確稱取每份為3.0 g的杏鮑菇粉若干份，置于燒杯中，按試驗設(shè)計要求加入磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，攪拌均勻后用超聲波粉碎機進行處理，然后加入復合酶(木瓜蛋白酶和纖維素酶按質(zhì)量比1∶1混合)并在恒溫水浴鍋中進行酶解。酶解后在沸水浴中放置5 min以滅酶活，再以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min后棄沉淀。在上清液中加入3倍體積的95%乙醇，在4℃冰箱中沉淀12 h，以去除多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。離心后吸取上清液1 mL放于 10.00 mL容量瓶中，按照文獻[4]中的方法測吸光值，并根據(jù)線性回歸方程和提取率計算公式計算出樣品中的黃酮提取率。每個樣品平行試驗3次。

1.3.3單因素試驗

(1)料液比對杏鮑菇黃酮提取率的影響：取5份杏鮑菇粉，每份3.0 g，分別按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)的料液比設(shè)置加入pH 5.4的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，先在400 W的超聲波功率下處理5 min，然后加入樣品量1.20%(W/W)的復合酶并在50℃下酶解浸提60 min。提取后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(2)超聲波功率對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波時間為5 min、酶添加量為1.20%、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，將5份杏鮑菇粉分別按照超聲波功率為200、300、400、500、600 W進行處理。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(3)超聲時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波功率為400 W、酶添加量為1.20%、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，將6份杏鮑菇粉分別超聲波處理3、4、5、6、7、8 min。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(4)酶解時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波功率為400 W、超聲時間為5 min、酶添加量為1.20%、酶解溫度為50℃，酶解時間分別設(shè)置為30、40、50、60、70 min。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(5)酶解溫度對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波功率為400 W、超聲時間為5 min、酶添加量為1.20%、酶解時間為60 min，酶解溫度分別設(shè)置為30、40、50、60、70℃。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(6)酶解pH對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、超聲波功率為400 W、超聲時間為5 min、酶添加量為1.20%、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，分別在5份杏鮑菇粉中加入pH 5.0、5.4、6.0、6.4、7.0的緩沖液。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

(7)酶添加量對杏鮑菇黃酮提取率的影響：固定料液比為1∶20(g/mL)、緩沖液pH 5.4、超聲波功率為400 W、超聲時間為5 min、酶解溫度為50℃、酶解時間為60 min，酶添加量分別設(shè)置為樣品量的0.60%、0.80%、1.0%、1.20%、1.40%、1.60%。處理后測定杏鮑菇黃酮提取率。

1.3.4正交試驗 得到單因素試驗的結(jié)果后，從對杏鮑菇黃酮提取率產(chǎn)生較大影響的4個單因素中選擇3個水平進行四因素三水平的正交試驗，確定出超聲波輔助復合酶法提取杏鮑菇黃酮的最優(yōu)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制標準曲線

根據(jù)試驗結(jié)果繪制標準曲線，得到測定黃酮含量的線性回歸方程為：y=10.908x-0.011 4，R2=0.993。

2.2 杏鮑菇黃酮提取的試驗結(jié)果

2.2.1單因素試驗

(1)料液比的影響：由表1可知，在料液比為1∶40時的提取率最高，說明料液比過高或過低都不利于黃酮類化合物的溶出。

表1 料液比對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(2)超聲波功率的影響：由表2可知，超聲波功率為500 W時，杏鮑菇黃酮的提取率最高。推測可能是超聲波功率過高時會破壞黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而功率過低則不利于杏鮑菇細胞的解體。

表2 超聲波功率對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(3)超聲時間的影響：由表3可知，超聲時間為7 min時，黃酮提取率最高。超聲時間過長或過短都不利于黃酮類物質(zhì)的分離提取。

表3 超聲時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(4)酶解時間的影響：由表4可知，酶解時間為60 min時，黃酮提取率最高。原因可能是酶解時間過短導致酶解反應(yīng)不完全，而酶解時間過長又會降低酶的活性，這都會降低黃酮的提取率。

表4 酶解時間對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(5)酶解溫度的影響：由表5可知，酶解溫度為60℃時，黃酮提取率最高。分析可能是過高或過低的溫度都影響了酶的活性，從而導致酶解效率降低。

表5 酶解溫度對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(6)酶解pH的影響：由表6可知，酶解pH為5.4時，黃酮提取率最高。說明此pH最有利于酶活性中心可解離基團的解離，因而酶的活性最高。

表6 酶解pH對杏鮑菇黃酮提取率的影響

(7)酶添加量的影響：由表7可知，酶添加量為1.4%時，黃酮提取率最高。

表7 酶添加量對杏鮑菇黃酮提取率的影響

2.2.2正交試驗結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在其他因素都固定為最佳值的情況下，選擇料液比、超聲時間、酶解溫度和酶解pH這4個對杏鮑菇黃酮提取率影響較大的因素進行正交試驗(表8、表9)。

表8 正交試驗因素水平

表9 正交試驗結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過單因素及正交試驗設(shè)計法對超聲波輔助復合酶法提取杏鮑菇黃酮的工藝條件進行了優(yōu)化研究。正交試驗的直觀分析結(jié)果顯示，當其他影響因素固定為由單因素試驗得到的最佳值時，A(料液比)、B(超聲時間)、C(酶解溫度)、D(酶解pH)4個因素對杏鮑菇黃酮提取率的影響程度為B>D>C>A，4個因素的最佳值分別是B1、D2、C1、A3，即杏鮑菇黃酮提取工藝的最優(yōu)條件為料液比為1∶50 (g/mL)、超聲時間為6 min、酶解溫度為50℃、酶解pH為5.4，在此條件下進行3次驗證試驗，得到杏鮑菇黃酮的平均提取率為3.352%。◇