曲廣男，馮穎，姜爽，孫悅

摘要：目的：研究成纖維細(xì)胞在皮膚損傷修復(fù)中的作用。方法： 建立大鼠背部皮膚損傷的動(dòng)物模型，將新生乳鼠的成纖維細(xì)胞懸液注射入受損部位，分別于傷后不同時(shí)間觀察大鼠背部創(chuàng)面的外觀變化及其愈合情況，用創(chuàng)面肉芽組織制作冰凍切片，以損傷皮膚的恢復(fù)情況來(lái)評(píng)價(jià)修復(fù)效果。結(jié)果：注射了成纖維細(xì)胞的大鼠，與未注射成纖維細(xì)胞的大鼠相比損傷修復(fù)的速度明顯變快，愈合指數(shù)較高。結(jié)論：成纖維細(xì)胞對(duì)組織缺損的修復(fù)有促進(jìn)作用。

關(guān)鍵詞：成纖維細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；皮膚損傷；創(chuàng)面愈合

項(xiàng)目基金：通化師范學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201710202033）；通化師范學(xué)院實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金

中圖分類(lèi)號(hào)：L929 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.18.022

成纖維細(xì)胞具有分布廣泛、取材方便、對(duì)機(jī)體損傷較小、體外培養(yǎng)容易成活、增殖較快等優(yōu)點(diǎn)，可進(jìn)行一般創(chuàng)傷修復(fù)和骨創(chuàng)傷修復(fù)。皮膚創(chuàng)傷會(huì)造成不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損，必須通過(guò)細(xì)胞增殖和細(xì)胞間質(zhì)的形成來(lái)進(jìn)行組織修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞療法將新生乳鼠的成纖維細(xì)胞注入皮膚損傷的動(dòng)物模型中，研究成纖維細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)中的作用[1-2]。

1材料與方法

1.1 材料、藥品與儀器

1.1.1 材料 新生大乳鼠、成年大鼠購(gòu)于吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物中心。

1.1.2 藥品 PBS緩沖液、40g/L中性蛋白酶、2.5g/lΙ型膠原酶、低糖DMEM、脫毛劑、咪達(dá)唑侖麻醉劑、臺(tái)盼藍(lán)染液、蘇木精染液、伊紅染液、二甲苯、10%中性甲醛、包埋劑、中性樹(shù)膠等。

1.1.3 儀器 低速離心機(jī)、恒溫?fù)u床、冷凍切片機(jī)，超凈工作臺(tái)等。

1.2 成纖維細(xì)胞體外的分離培養(yǎng)

1.2.1 分離表皮和真皮 新生大乳鼠處死后在75%酒精中浸泡3min，取背部皮膚，用PBS緩沖液洗滌3次，皮膚剪成5mm×5mm的小塊，置入40g/L中性蛋白酶溶液中消化3～4h。取出后PBS緩沖液洗滌，分離表皮層與真皮層，真皮備用。

1.2.2 制備細(xì)胞懸液 真皮剪碎后加入0.25%Ⅰ型膠原酶溶液，37℃恒溫?fù)u床振蕩4h，PBS稀釋終止消化，200目尼龍紗網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液。1200r/min離心5min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液。臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)[5]，調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度1.0×107個(gè)/ml。

1.3 大鼠皮膚損傷模型的建立及分組

對(duì)24只體重75g的大鼠進(jìn)行乙醚氣體吸入麻醉，腹腔注射1.4ml麻醉藥咪達(dá)唑侖稀釋液麻醉，背部用脫毛劑脫毛，常規(guī)消毒背部皮膚，前后各做一皮膚損傷創(chuàng)傷，創(chuàng)傷傷口的直徑約1.5cm，深達(dá)皮下，損傷不傷及肌肉，壓迫止血[6]。然后將大鼠隨機(jī)分成A、B兩組，A組12只，作為處理組，向創(chuàng)面皮膚真皮內(nèi)注射0.3ml的原液；B組12只，作為對(duì)照組，注射等體積的生理鹽水（0.9%的氯化鈉水溶液），為避免腫脹，多選幾個(gè)位置進(jìn)行注射。注射時(shí)為皮下注射給藥，分別將成纖維細(xì)胞和生理鹽水推入皮下結(jié)締組織，經(jīng)毛細(xì)血管、淋巴管吸收進(jìn)入血液循環(huán)。每只小鼠給予清潔飼料及自來(lái)水，分籠飼養(yǎng)，并保持創(chuàng)口干燥，用碘伏擦拭于創(chuàng)口處，間隔一天擦拭一次，直到傷后第12d，以防止創(chuàng)口感染。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 創(chuàng)面面積測(cè)定 傷后分別于第3d、6d、9d、12d用透明薄膜覆蓋創(chuàng)面并沿創(chuàng)緣劃線。動(dòng)物致傷后立即測(cè)的面積為傷口原始面積。愈合指數(shù)=（1-現(xiàn)切口面積/原切口面積）×100%[2]。

1.4.2 組織學(xué)檢查 傷后第12d頸椎脫臼法處死大鼠，畫(huà)出創(chuàng)面大小，然后剪下創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織，放于10%中性甲醛（福爾馬林）中固定1小時(shí)，生理鹽水洗滌，濾紙吸干其上的水后用包埋劑包埋于組織支撐器上，快速放于冷凍臺(tái)上冷凍，制作冰凍切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察，凡可觀察到真皮、表皮層的可進(jìn)行HE染色，在材料周?chē)渭又行詷?shù)膠，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）”表示，使用Excel統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用方差分析，兩兩比較，使用組間配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為有顯著性差異意義[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 給藥后創(chuàng)面外觀的變化

處理后的創(chuàng)面面積隨傷后時(shí)間延長(zhǎng)而不斷縮小[8]，注射了成纖維細(xì)胞的創(chuàng)面面積縮小最明顯，愈合程度大，并于傷后第12d創(chuàng)面長(zhǎng)出一層較密的毛，而對(duì)照組只長(zhǎng)有少量的毛。

2.2 創(chuàng)面愈合程度

（t檢驗(yàn)：平均值的成對(duì)二樣本分析，得出P<0.05，與對(duì)照組比較。）

造模后，隨時(shí)間的延長(zhǎng)創(chuàng)面面積逐漸縮小。傷后第3d，兩組大鼠的創(chuàng)面開(kāi)始逐漸縮小。傷后第12d大部分創(chuàng)面已經(jīng)愈合，A組的愈合程度強(qiáng)于B組，且愈合速度較快。經(jīng)t檢驗(yàn)，從傷后第9d開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞層數(shù)較多，分層明顯，創(chuàng)面愈合程度大，顯著高于對(duì)照組，有明顯的加速創(chuàng)面面積縮小的作用（P<0.05），差異顯著。

2.3 組織學(xué)檢查

在顯微鏡下，可以清晰地觀察到表皮層與真皮層，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B組細(xì)胞分層較為明顯，表皮層明顯增厚，真皮層中成纖維細(xì)胞大量增殖，而對(duì)照組的表皮層略微增厚（見(jiàn)圖1、圖2、圖3、圖4）。

3 討論

皮膚受損，成纖維細(xì)胞是最主要的修復(fù)細(xì)胞，是構(gòu)成肉芽組織的主要成分之一。損傷刺激后，成纖維細(xì)胞在趨化因子的作用下進(jìn)入創(chuàng)口并分裂增殖，與毛細(xì)血管及滲出的炎細(xì)胞構(gòu)成肉芽組織。在傷后5～7d肉芽組織達(dá)到高峰，成纖維細(xì)胞數(shù)量劇增，功能活躍[9]。

創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及創(chuàng)面炎性翻譯、肉芽組織增生以及再上皮化等主要過(guò)程。成纖維細(xì)胞應(yīng)用于創(chuàng)面總的效應(yīng)是促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)，主要表現(xiàn)在促進(jìn)新生肉芽組織生長(zhǎng)，深入比較處理組與對(duì)照組的促修復(fù)效果，發(fā)現(xiàn)處理組的效果較明顯，創(chuàng)面愈合程度明顯高于對(duì)照組，其愈合作用更強(qiáng)[8]。該細(xì)胞療法使細(xì)胞再生，從而使大鼠背部皮膚的成纖維細(xì)胞增多，并激活大鼠的受損細(xì)胞，最終創(chuàng)面愈合。

現(xiàn)已有專(zhuān)家學(xué)者提出成纖維細(xì)胞分泌的堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）可增強(qiáng)成纖維細(xì)胞的活性[10]。他們認(rèn)為有針對(duì)性地應(yīng)用生長(zhǎng)因子，治療既可最大限度發(fā)揮生長(zhǎng)因子本身的生物學(xué)作用，同時(shí)也會(huì)避免或預(yù)防許多可能的不良反應(yīng)，以達(dá)到經(jīng)濟(jì)與最佳的促修復(fù)效果。因此，在臨床應(yīng)用中成纖維細(xì)胞可廣泛應(yīng)用于體表創(chuàng)面修復(fù)的研究及醫(yī)療的其他領(lǐng)域[8]。

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作者簡(jiǎn)介：曲廣男，在讀本科生，研究方向：生物技術(shù)。

通訊作者：馮穎，碩士，講師，研究方向：干細(xì)胞細(xì)胞生物學(xué)。