林青偉，宋景春，曾慶波，鐘林翠，宋曉敏，張 昕

0 引 言

膿毒癥是國際性的醫(yī)學(xué)難題，具有高發(fā)病率、高病死率的特點(diǎn)[1]；且目前全球膿毒癥的年患病人數(shù)仍在增加[2]。膿毒癥患者一旦發(fā)展為重癥膿毒癥和膿毒性休克，病死率可分別高達(dá)25%～30% 和40%～70%。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膿毒癥合并凝血功能障礙的患者占膿毒癥總數(shù)的80%以上，病死率則更高[3]。

大黃素別名為朱砂蓮甲素，主要提取自中藥大黃的根莖，化學(xué)名為1,3,8-三羥基-6 甲基蒽醌( 1，3，8-trihydroxy-6-methyl-anthraquinone)，相對分子質(zhì)量為270.23，呈三環(huán)平面結(jié)構(gòu)，是分布最廣泛的一種羥基蒽醌類化合物。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為中藥大黃具有瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)已有研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可以緩解膿毒癥大鼠肺水腫的程度[4]。血栓彈力圖儀(thromboelastography，TEG)能夠監(jiān)測凝血動態(tài)的全過程，通過測定血栓形成速度、強(qiáng)度和溶解過程能夠真實(shí)而全面地反映凝血功能狀態(tài)。已有文獻(xiàn)報(bào)道TEG可監(jiān)測膿毒癥患者凝血功能變化，識別高凝與低凝狀態(tài)[5]。本研究旨在運(yùn)用TEG評價大黃素對膿毒癥大鼠凝血功能紊亂的治療作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物收集90只2月齡SD大鼠[購于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物部，合格證書：SYXK(贛2010-0002)]，體重(196.0±10.8) g。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)環(huán)境溫度19～23 ℃，空氣濕度為50%～60%，動物自由飲水飲食。

1.2儀器與試劑血栓彈力圖儀(西芬斯，購于北京樂普醫(yī)療科技有限責(zé)任公司)及配套試劑(包括高嶺土試劑瓶、纖維蛋白原試劑瓶、0.2 mol/L氯化鈣和普通杯等)；全自動凝血分析儀(RAC-500)購自雷杜醫(yī)療設(shè)備有限公司；大黃素(購于南昌樂悠生物有限公司，A606281-0025)溶液配置：準(zhǔn)確稱取1 g NaOH，用蒸餾水定容至100 mL，配制成1%NaOH溶液，準(zhǔn)確稱取大黃素100 mg溶于20 mL 1%NaOH溶液中配制成5 mg/mL 濃度溶液。10%水合氯醛(中國人民解放軍第一七五醫(yī)院生產(chǎn))。

1.3盲腸結(jié)扎模型采用鼠類盲腸結(jié)扎穿孔法(cecalligation and puncture，CLP)建立膿毒癥動物模型[6-7]。術(shù)前均禁食不禁水12 h，盲腸結(jié)扎組及大黃素組大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，常規(guī)腹部碘伏消毒、備皮和鋪無菌紗布洞巾，沿劍突下腹部腹中線切開腹壁皮膚約1 cm。用無菌鑷探查到盲腸后，用手術(shù)縫合線結(jié)距離回盲部1/2 處結(jié)扎大部分盲腸，20 G 無菌針頭分別于被結(jié)扎盲腸頭尾端穿孔，然后擠壓盲腸，使其內(nèi)容物沿穿孔部位擠出0.3 mL。將盲腸和擠出內(nèi)容物一起送回腹腔，逐層縫合腹壁切口。

1.4實(shí)驗(yàn)分組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將90只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、盲腸結(jié)扎組和大黃素組。每組隨機(jī)選取10只用于生存分析。假手術(shù)組無菌狀態(tài)下開腹尋找到盲腸后再將其還納腹腔，然后逐層關(guān)腹。假手術(shù)組術(shù)后灌胃等量等滲鹽水[10 mL/(kg·d)]，2次/d，按術(shù)后6、12、24 h 隨機(jī)處死大鼠并取血標(biāo)本；盲腸結(jié)扎組術(shù)后灌胃等量等滲鹽水，2次/d，按術(shù)后6、12、24 h 隨機(jī)處死大鼠并取血標(biāo)本；大黃素組在盲腸結(jié)扎術(shù)后灌喂大黃素[50 mg/(kg·d)]，2次/d，按術(shù)后6、12、24 h 隨機(jī)處死大鼠并取血標(biāo)本。

1.5常規(guī)凝血項(xiàng)目檢測靜脈采血2 mL，置于含有1/10體積的0.109 mol/L枸櫞酸抗凝液的試管中，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，離心半徑13.5 cm。收集上層血漿，采用全自動凝血分析儀檢測PT和APTT。

1.6 血栓彈力圖檢測

1.6.1普通杯檢測按說明書進(jìn)行檢測。測試完畢后記錄R值、K值、α角、MA和CI參數(shù)。其中R為凝血反應(yīng)時間，反映參加凝血啟動過程的凝血因子的綜合作用；K為從R時終點(diǎn)到描記幅度達(dá)到20 mm所需的時間，反映血塊形成速率，其中以纖維蛋白原功能為主；α角為血凝塊形成點(diǎn)到描記圖最大曲線弧度作切線與水平的夾角；MA為血凝塊最大振幅，主要反映血小板功能；CI為綜合凝血指數(shù)，直接反映整個凝血的高凝或低凝狀態(tài)。

1.6.2功能性纖維蛋白原檢測在軟件界面的測試類型中選擇“CFF”；在血栓彈力圖儀的通道上裝載一套樣品杯，取500 mL枸櫞酸化全血注入纖維蛋白原試劑瓶中，顛倒試劑瓶5次使之充分混勻，靜置4 min激活血液。余操作同普通杯檢測。測試完畢后記錄R值、MA值以及FLEV值。R時間是凝血蛋白反應(yīng)時間，表明外源性凝血通路的各血因子的活性及使用抗凝劑效果。MA值即最大振幅，直接反應(yīng)纖維蛋白網(wǎng)的交聯(lián)強(qiáng)度，代表纖維蛋白原在凝血過程中的貢獻(xiàn)。FLEV值為纖維蛋白原活性功能，由最大振幅MA值通過公式計(jì)算，反映血液中纖維蛋白原的含量。

2 結(jié) 果

2.1生存率分析術(shù)后48 h，假手術(shù)組大鼠無死亡，生存率為100%；盲腸結(jié)扎組大鼠存活2只，生存率為20%; 大黃素組大鼠存活4只，生存率為40%。大黃素組大鼠48 h生存率高于盲腸結(jié)扎組(P<0.05) 。見圖1。

2.2各組常規(guī)凝血項(xiàng)目比較與假手術(shù)組相比，盲腸結(jié)扎組的APTT均在CLP術(shù)后6 h明顯延長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在術(shù)后6 h大黃素組較盲腸結(jié)扎組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，盲腸結(jié)扎組和大黃素組大鼠的PT均在術(shù)后6 h顯著延長，隨后開始回縮，24 h縮短出現(xiàn)低峰(P<0.05)；但盲腸結(jié)扎組與大黃素組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖2。

圖1 各組小鼠術(shù)后48 h生存率比較

表1術(shù)后不同時間各組大鼠APTT、PT的比較[M(Q1～Q3),n=5]

組別APTT(s)PT(s)假手術(shù)組 6 h16.7(16.2～17.2)10.6(10.0～11.2) 12 h15.8(14.6～18.4)10.2(9.8～11.0) 24 h15.2(14.6～17.2)11.0(10.2～11.2)盲腸結(jié)扎組 6 h34.6(22.7～34.9)?24.7(15.3～31.6)? 12 h20.8(18.0～23.2)21.8(21.3～25.9)? 24 h20.4(16.5～21.3)18.6(17.9～19.0)?大黃素組 6 h15.3(14.9～24.5)#25.5(22.7～26.1)? 12 h19.4(16.3～23.4)18.7(18.6～24.2)? 24 h16.8(16.4～18.9)16.4(15.4～17.4)?與假手術(shù)組比較,?P<0.05;與盲腸結(jié)扎組比較,#P<0.05

2.3各組TEG普通杯測試參數(shù)假手術(shù)組中，R值、K值、α角、MA值以及CI值在術(shù)后12、24 h差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。盲腸結(jié)扎組中，R值各時間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；K值在術(shù)后12 h明顯降低，而后逐漸回升，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；α角、MA值以及CI值均在術(shù)后12 h開始顯著升高，于24 h到達(dá)頂點(diǎn)(P<0.05)。大黃素組中，R值、K值各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；α角、MA值以及CI值在均術(shù)后12 h開始顯著升高，于24 h到達(dá)頂點(diǎn)(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，盲腸結(jié)扎組的R值、K值在術(shù)后各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；α角僅在術(shù)后12 h顯著升高(P<0.05)，MA值、CI值僅在術(shù)后6 h顯著降低(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，大黃素組的R值、K值、α角及CI值在術(shù)后各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；MA值僅在術(shù)后6 h顯著降低(P<0.05)。與盲腸結(jié)扎組比較，大黃素組的R值、K值、α角、MA值以及CI值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖3。

表2術(shù)后不同時間各組大鼠TEG普通杯參數(shù)比較(n=5)

組別R(min)K(min)α角(°)MA(mm)CI假手術(shù)組 6 h1.6±0.60.9(0.8～1.0)76.9(76.3～82.0)74.6±5.85.8(5.2～6.9) 12 h1.7±0.50.9(0.8～1.1)75.9(76.0～81.4)74.2±5.75.6(5.0～6.6) 24 h1.6±0.51.0(0.9～1.0)76.2(72.3～81.0)75.9±3.55.4(5.5～6.0)盲腸結(jié)扎組 6 h1.4±0.51.7(1.0～2.8)67.2(58.6～76.9)?△62.8±9.4?2.9(2.1～5.5)? 12 h1.3±0.31.2(1.0～1.5)△73.4(69.9～77.3)72.1±8.05.7(4.2～6.7) 24 h1.7±0.20.9(0.8～1.1)77.7(74.5～80.3)△82.0±5.5△6.5(6.0～7.5)△大黃素組 6 h1.6±0.30.9(0.8～2.0)77.4(64.6～80.9)66.5±10.2?4.7(2.2～6.2) 12 h1.6±0.51.2(0.8～1.3)80.1(69.3～82.3)75.6±8.6△▲6.5(4.2～7.2) 24 h1.6±0.20.9(0.8～1.0)80.0(75.2～81.0)81.5±5.5△▲7.0(6.3～7.3)△與假手術(shù)組比較,?P<0.05;與盲腸結(jié)扎組比較, #P<0.05;與同組6h比較,△P<0.05;與同組12h比較,▲P<0.05

a：部分凝血活酶時間(APTT)；b：凝血酶原時間(PT)；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與盲腸結(jié)扎組比較，#P<0.05圖2 術(shù)后不同時間各組大鼠APTT、PT的比較

a：凝血反應(yīng)時間(R)；b：血塊最大強(qiáng)度(MA)；c：血塊形成速率(K)；d：血塊形成動力學(xué)(Angle)：e：凝血綜合指數(shù)(CI)；與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與盲腸結(jié)扎組比較， #P<0.05；與同組6 h比較，△P<0.05；與同組12 h比較，▲P<0.05圖3 術(shù)后不同時間各組大鼠TEG(普通杯)參數(shù)比較

2.4各組TEG功能性蛋白原測試參數(shù)比較假手術(shù)組中，R值、α角、FLEV值及MA值在各時間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。盲腸結(jié)扎組中，R值各時間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在術(shù)后12 hα角開始表現(xiàn)出增大趨勢(P<0.05)，24 h出現(xiàn)下降(P>0.05)。在術(shù)后12 h，MA值與FLEV值均開始表現(xiàn)出升高趨勢，并于24 h顯著增高(P<0.05)。大黃素組中，R值各時間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在術(shù)后12 hα角開始表現(xiàn)出增大趨勢(P<0.05)，24 h出現(xiàn)下降(P>0.05)。術(shù)后12 h MA值與FLEV值均開始表現(xiàn)出升高趨勢，并在在24 h顯著升高(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，盲腸結(jié)扎組的R值與α角在術(shù)后6、12、24 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在術(shù)后6h，盲腸結(jié)扎組的MA值與FLEV值均顯著降低，術(shù)后12 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均在24 h顯著升高(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，大黃素組的R值、α角在術(shù)后6、12、24 h差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后6 h大黃素組的MA值與FLEV值均顯著降低(P<0.05)，術(shù)后12 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，均在24 h顯著升高(P<0.05)。與盲腸結(jié)扎組比較，大黃素組的R值在術(shù)后6、12、24 h差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；α角在術(shù)后6 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在12、24 h時顯著升高；FLEV值及MA值在術(shù)后6和12 h差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在術(shù)后24 h，α角、FLEV值及MA值均顯著升高(P<0.05)。見表3，圖4。

表3術(shù)后不同時間各組大鼠TEG纖維蛋白原杯參數(shù)比較(n=5)

組別R(min)α角(°)MA(mm)FLEV假手術(shù)組 6 h1.2±0.174.1(70.4～80.0)27.0±4.1493.1±74.1 12 h1.2±0.176.9(75.3～82.0)25.4±3.9476.8±100.9 24 h1.1±0.177.9(74.6～81.0)27.5±4.2476.5±99.8盲腸結(jié)扎組 6 h1.1±0.169.5(67.3～70.4)18.2±1.3?331.4±24.0? 12 h1.1±0.373.3(73.1～75.7)△25.6±3.7△466.4±67.3△ 24 h1.2±0.070.8(69.2～78.4)28.2±4.0△515.3±73.7△大黃素組 6 h1.2±0.161.9(57.1～74.4)16.1±4.5?343.4±60.4? 12 h1.1±0.177.0(74.0～78.5)#△25.2±3.9△455.9±71.7△ 24 h1.2±0.179.3(75.0～80.0)#△▲35.2±4.8?#△▲642.3±87.3?#△▲與假手術(shù)組比較,?P<0.05;與盲腸結(jié)扎組比較, #P<0.05;與同組6h比較,△P<0.05;與同組12h比較,▲P<0.05

a:凝血反應(yīng)時間(R);b:纖維蛋白原血塊最大強(qiáng)度(MA);c:纖維蛋白原功能(FLEV);d:血塊形成動力學(xué)(Angle)與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與盲腸結(jié)扎組比較， #P<0.05；與同組6 h比較，△P<0.05；與同組12 h比較，▲P<0.05圖4 術(shù)后不同時間各組大鼠TEG(功能性纖維蛋白原杯)參數(shù)比較

3 討 論

膿毒癥是機(jī)體對感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙。該病具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重威脅人類健康[8]。近年來隨著研究的不斷深入,中醫(yī)藥治療膿毒癥成為研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)藥常通過多靶點(diǎn)、多途徑、多機(jī)制發(fā)揮作用，對于綜合調(diào)控復(fù)雜疾病更具優(yōu)勢與特色。因此，探討中藥對膿毒癥的治療作用具有重要意義。已有文獻(xiàn)報(bào)道大黃素能降低血清TNF-α、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平，抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)活性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的凋亡，從而起到抗炎的作用[9-11]。但大黃素對凝血功能的作用尚鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示,膿毒癥大鼠血小板及纖維蛋白原功能先減弱而后增強(qiáng)的變化，大黃素能增強(qiáng)膿毒癥大鼠內(nèi)源性凝血因子活性，改善纖維蛋白原功能，降低48 h病死率。

APTT是內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的綜合檢驗(yàn)指標(biāo)，PT反映的是外源性凝血途徑的狀況，R反映凝血因子活性。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,術(shù)后6h盲腸結(jié)扎組與大黃素組的APTT、PT均較假手術(shù)組明顯延長，這提示早期膿毒癥大鼠凝血因子活性減弱；同時大黃素組的APTT較盲腸結(jié)扎組明顯縮短，但PT無明顯差異；并且TEG普通杯檢測以及功能性纖維蛋白原檢測的結(jié)果均顯示術(shù)后各組R值均無顯著差異，其中功能性纖維蛋白原檢測中R值反映的是外源性凝血因子活性，這說明大黃素能增強(qiáng)膿毒癥大鼠的內(nèi)源性凝血因子活性，同時提示TEG普通杯測試可能對大鼠凝血因子活性變化不敏感。血栓彈力圖普通杯結(jié)果顯示術(shù)后6 h，盲腸結(jié)扎組的MA較假手術(shù)組顯著降低，而后呈上升趨勢，這提示膿毒癥大鼠早期血小板功能減弱，而后出現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢。但大黃素組的MA與盲腸結(jié)扎組無顯著差異，因此本研究未能證明大黃素對膿毒癥大鼠MA值有影響。

功能性纖維蛋白原的檢測原理是通過組織因子激活外源性凝血通路，并使用血小板抑制劑抑制GPIIb/IIIa受體阻止血小板聚集。因此,檢測的血塊強(qiáng)度僅包含纖維蛋白原的作用。功能性纖維蛋白原檢測結(jié)果顯示術(shù)后6 h,盲腸結(jié)扎組與大黃素的FLEV及MA值均較假手術(shù)組明顯降低，這提示膿毒癥大鼠早期纖維蛋白原功能減弱。盲腸結(jié)扎組與大黃素組的α角、FLEV值及MA值在術(shù)后12 h均呈現(xiàn)上升的趨勢，24 h顯著升高。這說明隨著膿毒癥的發(fā)展，大鼠纖維蛋白原功能增強(qiáng)。并且24 h與盲腸結(jié)扎組比較，大黃素組的FLEV值及MA值有顯著差異，故本研究證明大黃素能增強(qiáng)膿毒癥大鼠纖維蛋白原功能。

膿毒癥發(fā)生時，促凝物質(zhì)如組織因子上調(diào)，而抗凝物質(zhì)如抗凝血酶、血栓調(diào)節(jié)蛋白、組織因子途徑抑制物和蛋白C下調(diào)，以及纖維蛋白溶解機(jī)制受損等，并以促凝物質(zhì)上調(diào)導(dǎo)致高凝狀態(tài)最為重要[12-14]；同時炎癥介質(zhì)作用于毛細(xì)血管內(nèi)皮，使血管內(nèi)皮生理性抗凝血物質(zhì)減少或功能下降，血管內(nèi)血細(xì)胞促凝血機(jī)制加強(qiáng)，纖溶系統(tǒng)受損，加劇了凝血過程[15]。纖維蛋白原即是凝血因子I，是一種由肝臟合成的可溶性Ⅱ類急性相糖基化蛋白，由αA、βB和γ鏈相互連接。血漿含量2.0～4.0 g/L，生物學(xué)半衰期96～144 h，存在于吸附血漿中，可被凝血酶和因子ⅩⅢa作用后轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白[16]。在膿毒癥高凝狀態(tài)下，F(xiàn)IB作為凝血因子Ⅰ參與凝血過程，其活性增強(qiáng)。其次隨膿毒癥病情發(fā)展，血漿中纖溶酶原激活物抑制劑-1水平不斷升高，纖溶活性受到抑制，導(dǎo)致血液凝固性增加，大量纖維蛋白不能被及時降解，從而增加血漿纖維蛋白原[17]。與此同時，高水平的FIB水平又促進(jìn)與血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，介導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)，導(dǎo)致血液黏度增大，損傷血管內(nèi)皮，進(jìn)一步促進(jìn)凝血的過程[18]。因此隨膿毒癥發(fā)展，大鼠纖維蛋白原功能呈增強(qiáng)趨勢，體現(xiàn)為FLEV值逐漸升高，這或許能成為評估膿毒癥嚴(yán)重程度的指標(biāo)，可作為進(jìn)一步研究的方向。

綜上所述，盲腸結(jié)扎模型中，膿毒癥大鼠的整體凝血狀態(tài)表現(xiàn)為低凝傾向。具體機(jī)制為凝血因子功能減弱，血小板功能先增強(qiáng)后減弱，纖維蛋白原功能先減弱后增強(qiáng)。大黃素能夠改善膿毒癥大鼠內(nèi)源性凝血因子活性和纖維蛋白原功能，降低膿毒癥大鼠48 h病死率。