吳曉東，白春英

低氧/缺血（Hypoxia/ischemia，H/I）目前臨床上常見的病癥，是航天、深水、高原等極端環(huán)境中面臨的重要難題[1-2]，也是基礎(chǔ)科研有待攻克的研究領(lǐng)域.而低氧預(yù)適應(yīng)（Hypoxic preconditioning，HPC）是機體抵抗H/I的一種由多因素、多信號共同參與和相互作用的內(nèi)源性保護機制[3]，但是詳細機制還尚未明確.全長型酪氨酸激酶受體B（TrkB-FL）是腦衍化的向神經(jīng)因子特異性受體，其具有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，常在機體壓力下產(chǎn)生[4].TrkB-FL受體與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合后，能夠使靶點細胞區(qū)域內(nèi)TrkB受體上的酪氨酸殘基部位自身磷酸化程度加強，繼而激活下游一系列的連鎖反應(yīng)，這些改變對大腦的正常發(fā)育、突觸可塑性、遷移和定位、神經(jīng)元板層結(jié)構(gòu)的形成方面發(fā)揮重要的作用[5-6].

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究使用的是小鼠海馬神經(jīng)元細胞系HT22細胞株.

1.2 儀器與試劑

細胞培養(yǎng)箱（FORMA，Thermo）；超凈臺（1300SERIES，Thermo）；顯微鏡（DSZ2000，Thermo）；培養(yǎng)皿；CO2 孵育箱；非接觸式超聲儀（Bioruptor UCD-300，北京德泉興業(yè)公司）；酶標儀（MULJZSKAN FC）；蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（Trans-Blot）；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（fusion pulse 6，北京五洲東方科技）；小型臺式冷凍離心機（5424R，Thermo）.PBS緩沖液；蛋白酶抑制劑；丙烯酰胺凝膠；Tris.Hcl液；胎牛血清；新生牛血清；青鏈霉素；DMEM培養(yǎng)基；胰酶；鼠源一抗體及HRP標記羊抗鼠二抗體（生工生物公司）；顯影發(fā)光液（北京普利賴基因公司）.

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及傳代

顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞密度將要達到90%且細胞狀態(tài)較好時，可進行傳代，即棄掉舊培養(yǎng)基，加入2ml的PBS液，輕搖并清洗細胞.共洗兩次；洗最后一次時，加1ml胰酶于培養(yǎng)皿中，片刻后棄掉胰酶；把培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱內(nèi)，進行消化；片刻后，取出培養(yǎng)皿，加入3ml的完全培養(yǎng)基，慢慢地吹打細胞，將細胞吹打均勻；最后把混勻好的細胞懸液分裝到若干的培養(yǎng)皿中（一般取細胞吸打液加6ml培養(yǎng)基）；放置在培養(yǎng)箱中進行低氧處理.

1.3.2 細胞低氧模型的構(gòu)建

當(dāng)細胞的密度度達到70%左右時，慢慢的棄掉舊的培養(yǎng)基，并補加3ml的新培養(yǎng)基；當(dāng)細胞孵育7～8個小時后，立刻進行低氧處理.本實驗的低氧預(yù)適應(yīng)處理組的方法為：低氧20min、常氧20min、低氧20min、常氧20min、低氧20min、常氧 20min、低氧 20min、常氧 20min，循環(huán)次數(shù)為 5次，實驗條件為是99%的即為低氧；低氧預(yù)適應(yīng)處理完畢后，立即把低氧預(yù)適應(yīng)組以及低氧組的實驗細胞均放入CO2培養(yǎng)箱中進行低氧處理；低氧預(yù)適、低氧、常氧完畢后，將細胞進行提取，用于后續(xù)蛋白檢測實驗.

1.3.3 Western bolt

蛋白提取，將取收集好的細胞，放入高壓過的1.5mL EP管中，加入300μL細胞裂解液和1%蛋白酶抑制劑；50赫茲，50%的工作/間歇超聲破碎細胞，每換一管細胞都洗凈探頭；4℃ 15000g 離心15min；離心后繼續(xù)超聲破碎；4℃15000g離心25min；取上清液放入新1.5mLEP管中，-80℃保存.

蛋白濃度測定，設(shè)計A-I標準液孔、待樣品孔、空白對照孔，均做兩個復(fù)孔；取96孔板，在孔板中分別加入100μL工作液和5μL蛋白稀釋液、100μL工作液和5μL蛋白標準液；

蓋上板蓋，放入搖床中搖30min；放入酶標儀檢測吸光度，計算樣品濃度（C終）.

蛋白混合液配制，將測得的蛋白進行定量，見表1.V（蛋白所需體積）=m/C終，V1（抗氧化劑體積）=V/10，V2（Loading buffer體積）=（V1+V2）/3，V3上樣體積 =V+V1+V2；點樣或-20℃保存.

表1 蛋白混合液的配制

電泳，制備5%的濃縮膠和6%的分離膠，濃縮膠恒壓105V、分離膠恒壓65V，10μg蛋白質(zhì)加樣量；轉(zhuǎn)膜，恒流400mA、電壓80V 4小時；閉，用5%脫脂奶粉封2小時，用洗膜液洗3次；孵育一抗4℃搖床過夜（1；100）、再孵育二抗室溫搖床2小時.

顯影和曝片，用等體積的顯影A液、B液混合液浸泡膜并曝片.

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件，運用的統(tǒng)計學(xué)方法為方差分析（ANOVA）和T-Test檢驗，比較了低氧不同天數(shù)組與細胞低氧次數(shù)之間的差異，即實驗中P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 低氧預(yù)適應(yīng)后能對細胞產(chǎn)生耐受作用

圖1 細胞低氧后鏡下觀察結(jié)果（鏡下，×200）

由圖1所示，空白對照（圖1A）的細胞狀態(tài)良好.低氧組（圖1B）細胞形態(tài)明顯發(fā)生變化，有大量的小圓泡，可能是固縮的細胞，折光率增強.低氧預(yù)適應(yīng)組（圖1C）圓泡數(shù)量介于對照與低氧組之間，大部分細胞形態(tài)完好，核質(zhì)清晰可見，說明低氧模型和低氧預(yù)適應(yīng)模型構(gòu)建成功.

2.2 蛋白濃度和純度的測定

如圖2所示，根據(jù)標準曲線求得公式y(tǒng)=ax+bK=c（K越接近1越好），蛋白濃度R2(R平方值)在0.9～1之間，表明蛋白濃度較純，可用于本實驗.

圖2 蛋白濃度標準曲線

2.3 低氧預(yù)適應(yīng)HT22細胞中TrkB-FL的表達上調(diào)

如圖3所示，與對照組相比，急性低氧（0d）組HT22細胞中TrkB-FL蛋白表達有降低的趨勢，而低氧預(yù)適應(yīng)（4d）組HT22細胞中TrkB-FL蛋白表達有增加的趨勢；低氧預(yù)適應(yīng)組較低氧損傷組，其TrkB-FL蛋白表達明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05）.因此，TrkB-FL 可能在低氧預(yù)適應(yīng)中通過表達上調(diào)發(fā)揮神經(jīng)保護作用.

圖3 TrkB-FL的Western blot結(jié)果

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)適應(yīng)是機體在非致死性缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的內(nèi)源性保護機制[7].低氧預(yù)適應(yīng)可能是通過上調(diào)保護性因子表達或下調(diào)損傷性因子表達，從而達到內(nèi)源性保護作用.如在神經(jīng)系統(tǒng)，低氧預(yù)適應(yīng)可通過下調(diào)HESC、NR2B等因子產(chǎn)生神經(jīng)保護[8-9]，HPC通過高表達PKC、CaveOLI-3、Caspase-3、Bcl-2 等因子產(chǎn)生保護作用[10-11].但是目前分子機制仍未明確.而我們通過構(gòu)建低氧和低氧預(yù)適應(yīng)細胞模型，也是為了探索其中發(fā)揮作用的保護性因子及相關(guān)機制，以上實驗也證實了細胞低氧耐受隨著低氧次數(shù)的增加有上升的趨勢，表明模型構(gòu)建成功，一些因子表達可能發(fā)生變化，從而增加機體低氧耐受.

研究表明，當(dāng)機體處于H/I時TrkB-FL受體及其配體表達會發(fā)生改變[12]，不同程度的低氧都可以通過調(diào)控TrkB-FL的表達來影響腦部的生理功能，這種調(diào)控主要分為兩個方面.當(dāng)機體急性缺氧時，TrkB-FL在調(diào)控和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)生存和修復(fù)的方面起著很重要的作用[11].前人在急性缺氧對TrkB-FL表達影響的研究中發(fā)現(xiàn)急性低氧刺激是通過調(diào)控BDNF和TrkB-FL在神經(jīng)元中的表達來實現(xiàn)的，這表明二者在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要調(diào)節(jié)作用[13-14].此外，研究發(fā)現(xiàn)將神經(jīng)細胞分別放入急性低氧和常氧環(huán)境下培養(yǎng)，BDNF及TrkB-FL受體在急性低氧狀態(tài)下的結(jié)合明顯下降[15]，本實驗也證實了急性低氧（0d）組HT22細胞中TrkB-FL蛋白表達降低，由此可見急性低氧對TrkB-FL調(diào)節(jié)具有負性作用.小鼠經(jīng)多次低氧后，即低氧預(yù)適應(yīng)，TrkB通過與配體BDNF結(jié)合對神經(jīng)元損傷的修復(fù)和存活發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[16].本實驗也證實了低氧預(yù)適應(yīng)（4d）組HT22細胞中TrkB-FL蛋白表達增加，因此TrkB-FL可能在低氧預(yù)適應(yīng)中通過表達上調(diào)來發(fā)揮神經(jīng)保護作用.除此之外，低氧預(yù)適應(yīng)組與低氧損傷組相比，其TrkB-FL蛋白表達明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（*P＜0.05），由此可見，低氧預(yù)適應(yīng)時TrkB-FL在神經(jīng)元的損傷修復(fù)中起到重要作用.