李委紅，劉會平，孫娜新，陳沛，劉少娟，劉旭輝

（食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，教育部食品營養(yǎng)與安全重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

0 引 言

乳制品是優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的良好來源，其消化率遠高于植物蛋白質(zhì)，牛乳中的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為3%～4%，其中80%以上為酪蛋白。Waugh等[1]于1956年發(fā)現(xiàn)了酪蛋白中唯一含有糖成分的蛋白質(zhì)，即κ-酪蛋白。隨后Delfour等[2]發(fā)現(xiàn)，凝乳酶能特異性水解牛乳κ-酪蛋白中苯丙氨酸105-蛋氨酸106的酰胺鍵，生成不溶性的副κ-酪蛋白（1～105部分）和三氯乙酸（TCA）可溶性的酪蛋白糖巨肽（106～169部分）。副κ-酪蛋白存在于凝乳中，溶解于乳清中的GMP則一同被排出，因此乳清粉是GMP的重要原料。

酪蛋白糖巨肽（Casein glycomacropeptide，GMP或CGMP）是一種含有唾液酸（Sialic acid，SA）的活性糖基磷酸肽，其多樣化的生物功能活性主要與肽鏈上糖基和磷酸基團的不同有關(guān)[3]。目前，人們對GMP的分離純化方法及抗感染、抗炎、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群等生物活性進行了較為深入的研究。

1 GMP的結(jié)構(gòu)及特點

在牛乳GMP的11種遺傳變異型中，以A、B型最為重要，兩者的區(qū)別在于第136位和第148位氨基酸種類不同，A型為蘇氨酸136和天冬氨酸148，而B型為異亮氨酸136和丙氨酸148[4]。GMP主鏈上的絲氨酸127,149為磷酸化位點，5種糖基（見表1）通過O-糖苷鍵與絲氨酸或蘇氨酸共價連接，且糖鏈中富含SA[3-5]。

表1 GMP的糖鏈組成

酪蛋白糖巨肽幾乎不含苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，含有較多的支鏈氨基酸（如纈氨酸和亮氨酸），可用于苯丙酮酸尿癥患者（不能代謝芳香族氨基酸）和肝臟病患者的膳食中和修飾蛋白濃縮物[6-7]。GMP無二級結(jié)構(gòu)，p I較低，親水性比其他乳清蛋白高，在酸性條件下含有凈負電荷，且具有熱穩(wěn)定性和可溶性。GMP含有大量具有生理活性的SA，且其復(fù)雜的糖肽結(jié)構(gòu)賦予GMP多樣化的生理功能性。

2 GMP的制備及分析方法

2.1 GMP的制備

乳清粉和牛乳酪蛋白是制備GMP的重要原料，相比酪蛋白，乳清粉在分離純化前無需酶解，研究者們更青睞于以乳清粉為原料來獲得GMP。

2.1.1 沉淀法

沉淀法主要包括冷乙醇沉淀、(NH4)2SO4沉淀和TCA沉淀，利用GMP的熱穩(wěn)定性和沉淀法可從乳清粉中獲得GMP。Rojas E等[8]對乳清粉進行90℃熱處理，沉淀離心后的產(chǎn)品平均回收率為34.08%；吳疆[9]分別利用TCA和硫酸銨二次沉淀分離得到GMP，硫酸銨沉淀法得到的GMP純度為85.07%。

2.1.2 層析法

層析法主要包括離子交換法、凝膠過濾色譜、親和層析和疏水色譜等，可獲得產(chǎn)品純度及SA含量均較高的GMP。Nakano等[10]利用丙烯葡聚糖凝膠S-200色譜先后在p H=7.0和p H=3.5條件下純化GMP，提純后的GMP占酪蛋白酸溶液干重的5.6%；Sliva-Hernandez等[11]利用陰離子交換和疏水作用色譜法從山羊甜乳清提取GMP，得率為0.6 g/L；陳緒卓等[12]將乳清粉經(jīng)TCA沉淀及IRA93離子交換樹脂處理后，GMP得率在74%左右；刁瑞麗等[13]利用優(yōu)化得到陰離子交換樹脂分離工藝，從100 g乳清粉中得到1.45 g GMP（SA含量為10.4%）。層析法雖然分離效果較好，但高成本使其難以推廣到產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程中。

2.1.3 超濾法

利用不同pH值下GMP分子量具有差異性這一特性，可選用適當截留分子量的超濾膜分離GMP。將干酪乳清pH值分別調(diào)至3.1和6.7，先后過20 kd和5 kd的超濾膜，可獲得純度較高的GMP。馬嵐[15]和趙浩宇等[16]

先利用無水乙醇使大部分雜蛋白沉淀（可降低料液粘度，提高超濾效率），再將上清液進行超濾，得到的CGMP純度分別達到92.45%和92.62%；張秀媛等[17]

采用超濾法得到相對較純的GMP，蛋白質(zhì)回收率為1.77%；曹榮安等[18]通過單因素和正交試驗確定了GMP的超濾和納濾工藝參數(shù)，在最優(yōu)工藝下GMP純度可達74.50%。膜過濾技術(shù)和離子交換色譜均能有效分離純化GMP，因此研究者常結(jié)合兩種方法從干酪乳清、酶凝干酪乳清和WPC原料中分離GMP，可以達到較好的純化效果。Kreuβ等[19]利用陰離子交換膜吸附色譜法進行GMP半規(guī)?；a(chǎn)，經(jīng)超濾后產(chǎn)品純度達91%；胡贊揚[20]和王子波等[21]

利用超濾和離子交換層析制備的GMP純度分別為83.97和96.56%。膜分離法操作簡便，較適用于工業(yè)化生產(chǎn)，但膜污染問題制約了該方法的廣泛應(yīng)用。

2.1.4 雙水相系統(tǒng)法

雙水相系統(tǒng)法是根據(jù)生物分子在雙水相體系中選擇性分配來達到分離的目的。Silva等研究證明16%聚乙二醇（PEG）1500+11.43%磷酸鉀（p H=7.0）和15.0%PEG 1500+18.9%檸檬酸鈉（pH=8.0）雙水相系統(tǒng)的GMP回收率分別為93.95%和95%[22-23]；Wu等[24]利用18%PEG 6000+15%硫酸銨雙水相系統(tǒng)的蛋白回收率為69.2%。此方法雖然GMP回收率高，但存在產(chǎn)品純度低、浪費水資源的問題。

2.1.5 殼聚糖法及其他

殼聚糖為弱堿性，表面帶正電荷，將殼聚糖小球加以修飾后可用于分離GMP。Li C等[25]利用β-環(huán)糊精修飾殼聚糖，可將GMP的吸附量增至90.23%；閆亞麗等[26]在殼聚糖法分離GMP的最佳工藝條件下可回收83.3%的GMP（SA質(zhì)量分數(shù)為10 mg/g）。王艷萍等[27]在最佳酶解條件下酶解酸凝干酪素，此方法的GMP得率為17.91 mg/g；Tolkach[28]結(jié)合酶聯(lián)技術(shù)和膜分離技術(shù)分離CMP及乳清蛋白，且分離效果較好；李博智等[29]利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶結(jié)合微濾技術(shù)得到純度為70%的GMP；Kim等[30]利用基因工程法獲得相應(yīng)的GMP粗品，在超濾和離子交換層析后得到重組人乳GMP純度高達94%以上。

2.2 GMP的分析方法

由于乳源GMP有多種變異體，故迄今為止還沒有非常成熟的直接測定方法，只能進行定性和間接定量分析。

2.2.1 比色法

GMP幾乎不含芳香族氨基酸，因此在普通蛋白檢測波長280 nm處無吸收峰且考馬斯亮藍法無法對其質(zhì)量分數(shù)進行測定。GMP僅在205～217 nm范圍內(nèi)可檢測到吸收值，因此經(jīng)常用OD280/OD210的值來間接反映GMP的純度[20]。雖然比色法操作便捷，但準確度不高。

2.2.2 間苯二酚-鹽酸法

GMP中含SA的的結(jié)合糖鏈高達90%以上，因此檢測其包含的SA質(zhì)量分數(shù)可間接反映樣品中GMP的質(zhì)量分數(shù)。間苯二酚-鹽酸法是測GMP中SA質(zhì)量分數(shù)的常用檢測方法，其能夠同時測定游離和結(jié)合的SA，但特異性和靈敏性都較低[31]。

2.2.3 電泳法

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是測定蛋白分子量的常用方法，但是此方法僅適用于檢測多聚體的GMP且不能檢測到大多數(shù)含唾液酸的GMP，因此誤差較大[32]。此外，利用SDS-尿素凝膠電泳和醋酸纖維素（CAS）電泳也可得出GMP的大致分子量和質(zhì)量分數(shù)。

2.2.4 高效液相色譜法

利用反相高效液相色譜法可以進行GMP成分及SA質(zhì)量分數(shù)的分析[33]；閆亞麗等[34]對多種常用的GMP檢測方法進行了比較分析，并認為高效液相色譜法具有純度誤差小等優(yōu)點；Molle等[35]在檢測GMP時采用色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，定量地測出GMP的總量。雖然反相高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用是檢測GMP較有效的方法，但仍然無法獲得完整的GMP圖譜。

2.2.5 氨基酸組成測定法

蛋白質(zhì)和多肽均有特定的氨基酸組成，因此通過測定樣品的氨基酸組成，將結(jié)果同其理論值對比后即可確定樣品純度。Thoma等[36]利用氨基酸分析儀測定了GMP氨基酸組成，并將氨基酸摩爾質(zhì)量與理論值進行對比，最終算出產(chǎn)品純度。

3 GMP的生理活性

GMP的生物活性和營養(yǎng)特性均較為豐富，在藥品、保健食品等領(lǐng)域應(yīng)用前景較為廣闊。

3.1 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)應(yīng)答及抗炎

當機體受到抗原刺激時，免疫系統(tǒng)會通過一系列的生理反應(yīng)以清除抗原，從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，即為免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)。GMP抑制結(jié)腸組織細胞的凋亡，誘導(dǎo)小鼠腸黏膜產(chǎn)生獲得性免疫應(yīng)答，緩解潰瘍性結(jié)腸炎[37-38]。Mu?oz等[39]發(fā)現(xiàn)GMP可通過抑制Th2型免疫應(yīng)答緩解過敏性皮炎及瘙癢癥狀；Sawin等[40]證明GMP可降低脫硫孤菌屬（與炎癥性腸病的發(fā)病機制和生成硫化氫細胞毒性化合物有關(guān)）、增加短鏈脂肪酸（可增強腸屏障功能和降低p H值），從而發(fā)揮腸道抗炎作用；Cheng X等[41]提出GMP木瓜蛋白酶酶解物可抑制脂多糖與Toll樣受體-4/髓樣分化蛋白2復(fù)合體結(jié)合，阻斷巨噬細胞中核因子-κB通路，抑制脂多糖刺激性炎癥反應(yīng)，且效果顯著優(yōu)于GMP本身。

3.2 抑制細菌和病毒粘附

GMP與受體的高相似性有利于阻止病毒或細菌結(jié)合受體，進而抑制病毒或細菌在宿主細胞定植。Kawasaki等[42]發(fā)現(xiàn)GMP對流感病毒紅細胞凝集具有抑制作用，而且唾液酸在GMP與流感病毒的反應(yīng)中起著不可或缺的作用；Dosako等[43]發(fā)現(xiàn)GMP可以抑制Epstein-Barr病毒誘導(dǎo)的外周血淋巴細胞的形態(tài)改變；Zhang&Shapiro[44]發(fā)現(xiàn)木糖醇與GMP具有協(xié)同效應(yīng)，不僅可以防齲齒還能重新礦化牙齒；劉鵬[45]證明其制取的GMP粗提物對變形鏈球菌有較高的抑制率，在質(zhì)量濃度為12 mg/mL時可達88%。

3.3 結(jié)合大腸桿菌毒素及霍亂毒素

霍亂毒素是霍亂弧菌產(chǎn)生的外毒素，其亞單位B一旦與細胞壁上寡糖結(jié)合后，A亞單位活化細胞的腺普酸環(huán)化酶，會使細胞失水，從而引起腹瀉。Oh等[46]證實糖基化GMP可以通過結(jié)合霍亂毒素來抑制毒素與受體結(jié)合；Isoda等[47]發(fā)現(xiàn)GMP可以抑制大腸桿菌腸毒素（LT-I及LT-II）與中國倉鼠卵巢細胞（CHO-K1）的結(jié)合；Rong等[48]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)GMP可以顯著緩解由大腸桿菌感染引起的生長性能下降和腹瀉，抑制仔豬腸道炎癥。

3.4 促進腸道益生菌的增殖

N-乙酰葡糖胺或寡糖末端有N-乙酰葡糖胺的結(jié)構(gòu)可促進雙歧桿菌生長。Gyorgy等[49]發(fā)現(xiàn)GMP經(jīng)唾液酸酶水解后會暴露出次末端的N-乙酰葡糖胺，從而能促進雙歧桿菌生長。任效東等[50-52]研究了GMP對小鼠腸道菌落環(huán)境的影響，實驗證明GMP具有調(diào)控和促進腸道雙歧桿菌等有益菌，同時抑制腸桿菌、腸球菌等致病菌的作用，乳源GMP可通過調(diào)節(jié)失衡的腸道菌群來改善結(jié)腸炎；李楠等[53]提出GMP酶解物對歧桿菌的促生長效果優(yōu)于GMP本身，且有效成分可能是水解產(chǎn)生的多肽類物質(zhì)。

3.5 抑制胃腸道分泌物

GMP會刺激小腸黏膜分泌縮膽囊素（可抑制胃酸等的分泌）[54]，胃液分泌量的減少可使活性分子（溶菌酶、免疫球蛋白和乳鐵蛋白等）不被胃過多消化，完整地進入小腸并被高效吸收，從而達到有效保護胃腸道的效果。通過動物實驗發(fā)現(xiàn)飼喂或灌胃GMP可以在1～2 h內(nèi)明顯抑制胃液分泌，但靜脈注射GMP無抑制胃分泌或改變胃腸激素血漿水平的作用[55]。

3.6 調(diào)節(jié)脂肪代謝

科學(xué)家們運用基因工程技術(shù)從釀酒酵母菌上得到了重組人GMP，實驗表明此GMP是通過增加脂肪排出量的方式調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、預(yù)防脂質(zhì)堆積和肥胖[30]。劉雪姬等[56]經(jīng)實驗證明調(diào)控腸道菌落微環(huán)境可以降低高脂飲食所引發(fā)的代謝性疾病發(fā)病率；成雪等[57]通過脂肪細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)GMP酶解物對脂肪組織炎癥的抑制作用顯著；Xu等[58]提出GMP對小鼠由高脂肪飲食引起的肥胖有改善作用，可促進脂肪分解代謝，減少脂肪堆積。上述研究為GMP可調(diào)節(jié)脂肪代謝及肥胖相關(guān)炎癥提供了理論基礎(chǔ)。

3.7 抑制糖尿病、抗氧化等活性

Song等[59-60]發(fā)現(xiàn)GMP酶解物可以對二肽基肽酶-4產(chǎn)生抑制作用，且IPPKKNQDKTE肽段可通過AMP依賴的蛋白激酶活化作用調(diào)控胰島素受體底物-1/磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路，改善Hep G2細胞由高糖引起的抗胰島素性，對抑制糖尿病方面有潛在作用；Li等[61]發(fā)現(xiàn)GMP酶解物可通過上調(diào)HepG2細胞內(nèi)的HO-1的表達來緩解細胞氧化應(yīng)激損傷；在含β-乳球蛋白食物的體外消化過程中若存在GMP，可顯著減少β-乳球蛋白與免疫球蛋白結(jié)合，降低β-乳球蛋白潛在過敏性[62]；GMP還具有促進礦物質(zhì)吸收、促進智力、抗血栓等作用。

4 結(jié)語

相比國外，國內(nèi)關(guān)于GMP的分離純化及生物活性研究較落后，國外已經(jīng)將GMP應(yīng)用于牙膏、餅干、餅干、嬰幼兒食品及醫(yī)藥制品中。近些年，我國對GMP的生物功能研究正逐步全面化，至今已已對其免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗血凝、調(diào)節(jié)胃腸道、抗氧化等活性進行相關(guān)研究。由于GMP在乳清粉中的含量較低，提取率不高，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前并沒有經(jīng)濟有效的適合規(guī)?；a(chǎn)GMP的分離純化方法，因此在國內(nèi)并沒有實現(xiàn)市場化。GMP的獨特結(jié)構(gòu)和生物功能具有極高的研究價值，隨著科技技術(shù)的發(fā)展，GMP將會在國內(nèi)逐步實現(xiàn)工業(yè)化，并應(yīng)用于食品、藥品及化妝品領(lǐng)域。