李濤，周艷華，孫桂芳，楊滔，楊慶懿

(1.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院長(zhǎng)沙 410111；2.長(zhǎng)沙環(huán)境保護(hù)職業(yè)技術(shù)學(xué)院長(zhǎng)沙 410004）

0 引 言

特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品（以下簡(jiǎn)稱(chēng)特醫(yī)嬰配食品）是部分患病嬰兒生命早期或出生后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)賴(lài)以生存的唯一或主要食物來(lái)源，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品通則》對(duì)各項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)進(jìn)行規(guī)定[1-2]。維生素E又名生育酚，具有多種異構(gòu)體，具有消除體內(nèi)自由基、促進(jìn)血液循環(huán)等多種生理功能，自然界分布最廣泛和含量最高的是α-生育酚[3]。α-生育酚醋酸酯是由α-生育酚的酚羥基乙?；玫剑灰资芸諝?、光、紫外線的作用氧化，具有更好的穩(wěn)定性和藥理功效[4]。維生素E是特醫(yī)嬰配食品中一項(xiàng)重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)，對(duì)于嬰兒尤其是新生兒、早產(chǎn)兒的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程有著重要的影響，添加形式為α-生育酚及α-生育酚醋酸酯[5-7]。目前，現(xiàn)有維生素E測(cè)定主要有液相法和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，現(xiàn)有食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中維生素E測(cè)定是一般需對(duì)樣品進(jìn)行酶解、皂化、提取、分離、濃縮等步驟，操作極其繁瑣耗時(shí)[8-10]。特醫(yī)嬰配食品中維生素E的檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道，特醫(yī)嬰配食品有6種配方，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)依照現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中皂化條件進(jìn)行皂化，會(huì)出現(xiàn)皂化不完全、嚴(yán)重乳化、維生素E結(jié)果偏低等現(xiàn)象，且α-生育酚不穩(wěn)定，在此分析過(guò)程中易損耗，回收率不高，不能進(jìn)行批量操作。此試驗(yàn)采用正向高效液相色譜直接測(cè)定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中的α-生育酚和α-生育酚醋酸酯[11]。此檢驗(yàn)方法能準(zhǔn)確測(cè)定產(chǎn)品中α-生育酚營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化類(lèi)別及含量，指導(dǎo)特醫(yī)生產(chǎn)企業(yè)對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量控制，也為特醫(yī)嬰配食品中維生素E檢測(cè)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

特醫(yī)無(wú)乳糖配方奶粉（A）、特醫(yī)乳蛋白部分水解配方奶粉（B）、特醫(yī)乳蛋白深度水解配方奶粉（C1）/氨基酸配方奶粉（C2）、特醫(yī)早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方乳(D)、特醫(yī)母乳營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑（E）、特醫(yī)氨基酸代謝障礙配方乳（F）來(lái)源于雅培等企業(yè)。

標(biāo)準(zhǔn)品：純度96.0%DL-α-生育酚（上海安譜）；純度98.4%DL-α-生育酚醋酸酯，（Dr.E）；異丙醇、叔丁基甲醚、正己烷、甲醇、無(wú)水乙醇、異辛烷、均為色譜純（上海安譜）；對(duì)苯二酚、冰醋酸、無(wú)水乙酸鈉、鹽酸，均為分析純（上海安譜）；木瓜蛋白酶＞400 U/mg，（BoMei0696）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀(帶DAD檢測(cè)器，日本島津公司)，HMS-350漩渦振蕩器（上海珂淮儀器有限公司），BS224S電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司），X 1R臺(tái)式冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司），PB-10 pH酸度計(jì)（德國(guó)賽多利斯公司），HWS-28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別稱(chēng)取α-生育酚醋酸酯和α-生育酚約25 mg（準(zhǔn)確至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，異辛烷溶解并定容至刻度。分別精取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液至10 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得100.0μg/mL混標(biāo)儲(chǔ)備液，分別精取0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、4.0 mL混標(biāo)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得濃度為0.5～40.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2 供試品溶液的制備

（1）樣品稱(chēng)量固體樣品混勻后精確稱(chēng)重0.5 g至50 mL離心管；液態(tài)樣品精確稱(chēng)取5.0 g至50 mL離心管中。

（2）酶解800 U/mL木瓜蛋白酶溶液：稱(chēng)取250 mg對(duì)苯二酚和10.0 g無(wú)水醋酸鈉于250 mL容量瓶中，加水200 mL溶解，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，加入0.5 g木瓜蛋白酶超聲5 min，冷卻后定容至刻度。向樣品溶液中加入5.0 mL木瓜蛋白酶溶液，混勻后置于37±2℃水浴30 min后冷卻。

（3）提取向酶解液中加入20.0 mL 2%醋酸甲醇，振蕩15 min，精密加入10.0 mL異辛烷振蕩提取15 min，5 000 r/min離心機(jī)中離心10 min，取異辛烷層用于高效液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax NH2（4.6 mm×150 mm×5 μm）；流動(dòng)相A為正己烷，流動(dòng)相B為25%叔丁基甲醚正己烷，流動(dòng)相梯度洗脫程序詳見(jiàn)表1；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：50μL；熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為310 nm。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

取標(biāo)準(zhǔn)使用液注入液相色譜儀測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1和圖2。α-生育酚醋酸酯線性方程為：Y=266 153.35X+2 760.08(R2=0.999 9)，α-生育酚線性方程為 Y=1 552 209.8X-89 555.89(R2=0.999 5)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度在0.5～40.0μg/mL范圍內(nèi)，校準(zhǔn)曲線線性良好。

圖1 α-生育酚醋酸酯標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2 α-生育酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 檢出限和定量限

取空白響應(yīng)值的2～3倍對(duì)應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5μg/mL，平行測(cè)定11次，根據(jù)檢出限的計(jì)算方法LOD=3sd/b和LOQ=10sd/b(sd為標(biāo)準(zhǔn)偏差，b為工作曲線斜率)，當(dāng)取樣量為0.5 g，異辛烷提取體積為10.0 mL時(shí)，方法檢出限和定量限見(jiàn)表2。此方法的檢出限與定量限低于GB 5009.82-2016，說(shuō)明此檢驗(yàn)方法具有更高的靈敏度。

2.3 樣品含量測(cè)定和精密度試驗(yàn)

特醫(yī)嬰配食品A-F分別平行取樣6組，按供試品溶液制備方法制備，進(jìn)液相色譜測(cè)定，特醫(yī)嬰配食品A-F號(hào)中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚含量及精密度結(jié)果見(jiàn)表3和表4。結(jié)果顯示6種特醫(yī)嬰配食品配方中均添加α生育酚醋酸酯和α-生育酚，且添加量依據(jù)適用對(duì)象的差異而不同，母乳營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑中α-生育酚醋酸酯含量最高，氨基酸配方中α-生育酚含量最高；各配方中α-生育酚醋酸酯含量為0.37～69.0 mg/100g，精密度為0.6%～9.9%，α-生育酚含量為0.16～8.4 mg/100g，精密度在1.3%～7.2%之間，精密度均滿(mǎn)足測(cè)定要求。

表2 檢出限和定量限

表3 特醫(yī)嬰配食品中α-生育酚醋酸酯含量及精密度

表4 特醫(yī)嬰配食品中α生育酚含量及精密度

2.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

選取深度水解配方奶粉（C1）為代表進(jìn)行特醫(yī)嬰配食品回收率試驗(yàn)，共9份，每個(gè)濃度3份，分別添加12.0μg、24.0μg、40.0μg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進(jìn)液相色譜測(cè)定。α-生育酚醋酸酯和α-生育酚加標(biāo)回收率見(jiàn)表5。由表5可知，α-生育酚醋酸酯在不同添加濃度下回收率在80.2%～91.1%之間，RSD值為0.7%～5.4%，α-生育酚在不同添加濃度下回收率在80.4%～94.8%之間，RSD值為1.8%～5.8%之間，深度水解配方奶粉為特醫(yī)嬰配奶粉中最復(fù)雜基質(zhì)之一，說(shuō)明該方法對(duì)特醫(yī)嬰配食品中不同濃度α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確度。

表5 樣品加標(biāo)回收率

2.5 檢驗(yàn)方法的選擇性

圖3和圖4分別為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和7種特醫(yī)嬰配食品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的圖譜，α-生育酚醋酸酯保留時(shí)間為4.7 min，α-生育酚保留時(shí)間為12.1 min，樣品長(zhǎng)時(shí)間測(cè)定過(guò)程中α-生育酚醋酸酯保留時(shí)間會(huì)發(fā)生一定變化，因此測(cè)定過(guò)程中需添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定性。特醫(yī)嬰配食品成分及其復(fù)雜，但應(yīng)用熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，由圖4可知，未發(fā)現(xiàn)基質(zhì)干擾，表明該檢驗(yàn)方法對(duì)特醫(yī)嬰配食品中中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚具有良好選擇性，分離度高。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立正相液相色譜測(cè)定特醫(yī)嬰配食品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的測(cè)定方法。采用木瓜蛋白酶酶解蛋白質(zhì)，游離包裹的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚，酸化甲醇沉淀蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，異辛烷提取，氨基柱正相分離，熒光檢測(cè)。在0.5～40.0μg/mL范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，α-生育酚醋酸酯和α-生育酚檢出限分別為5.6μg/100g和6.9μg/100g，不同添加濃度回收率為80.2%～94.8%。

圖4 特醫(yī)嬰配食品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

維生素E活性用α-生育酚當(dāng)量（α-TE）表示，1 mgα-TE=1 mg d-α-生育酚，用此檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)特醫(yī)嬰配食品中維生素E（α-TE）含量時(shí)需折算，1 mg dl-α-生育酚=0.74 mg d-α-生育酚，1 mg dl-α-生育酚醋酸酯=0.67 mg d-α-生育酚，此檢驗(yàn)方法的線性范圍和檢出限均優(yōu)于現(xiàn)有食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82-2016。前期試驗(yàn)研究表明現(xiàn)有國(guó)標(biāo)測(cè)定特醫(yī)嬰配食品中α-生育酚時(shí)，多種配方產(chǎn)品皂化時(shí)會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象嚴(yán)重、皂化不完全和精密差等問(wèn)題。本試驗(yàn)方法采用直接測(cè)定樣品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚，避開(kāi)操作繁雜的皂化過(guò)程，操作簡(jiǎn)單，精密度和準(zhǔn)確度高，可實(shí)現(xiàn)批量檢測(cè)。此試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，針對(duì)特醫(yī)嬰配產(chǎn)品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚檢測(cè)重復(fù)性好，為特殊醫(yī)學(xué)用途食品生產(chǎn)廠家進(jìn)行質(zhì)量控制提供指導(dǎo)，也為檢測(cè)特醫(yī)嬰配食品中維生素E提供技術(shù)參考。