陳小偉,程勇杰,范昊安,薛淑龍,蔣立新, 張 婷,王珍珍,毛旸晨,沙如意,*,毛建衛(wèi),*

(1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江杭州 310023; 2.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江杭州 310023; 3.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310023; 4.杭州醫(yī)學(xué)院,浙江杭州 310053)

植物酵素是以一種或多種蔬菜、水果和豆谷類(lèi)、海藻類(lèi)、藥食兩用本草類(lèi)、菌菇類(lèi)植物等為原料,加(或不加)糖類(lèi)物質(zhì),經(jīng)加入單種或多種益生菌發(fā)酵(或不加菌依靠植物表面本身保留的微生物發(fā)酵),經(jīng)過(guò)低溫長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵而產(chǎn)生的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品[1-2]。草莓作為大眾喜歡的水果,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,被譽(yù)為“水果皇后”[3],具有保健功能,兼有保護(hù)視力,助消化,防止便秘等功效[4]。其本身含有豐富的維生素C、多酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、花青素等多種功能性成分[5]。

氨基酸是重要的生命物質(zhì),是組成生物體中酶和蛋白質(zhì)的基本單元[6]。植物酵素中含有大量風(fēng)味氨基酸和人體必需氨基酸,目前對(duì)于植物酵素蛋白質(zhì)和氨基酸的研究主要包括蛋白質(zhì)含量檢測(cè)[7]、氨基酸分析與功能因子的相關(guān)性[8],因此對(duì)植物酵素進(jìn)行氨基酸分析與蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分評(píng)估極有必要[9]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),GABA含量異常與人體多種神經(jīng)和精神疾病,如帕金森綜合癥[10]、癲癇[11]、焦慮[12]等有關(guān)[13]。Ge等[14]研究發(fā)現(xiàn)GABA在成人大腦新生成的神經(jīng)元突觸融合中起重要作用,神經(jīng)元活動(dòng)調(diào)節(jié)成人神經(jīng)發(fā)生,新的神經(jīng)元有助于特定的腦功能。目前還未見(jiàn)關(guān)于植物酵素氨基酸和蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)的研究報(bào)道,本文對(duì)草莓酵素氨基酸和蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)的同時(shí),還利用氨基酸味覺(jué)閾對(duì)草莓酵素的風(fēng)味進(jìn)行評(píng)估,確定發(fā)酵過(guò)程中各種風(fēng)味氨基酸對(duì)味覺(jué)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓 采摘于杭州黃爺爺生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司,選擇八分熟的新鮮無(wú)病蟲(chóng)害,個(gè)體完整的草莓果實(shí),個(gè)體重量為(23.00±6.00) g;發(fā)酵用糖漿和酵素菌液 由浙江省農(nóng)副產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,采用常溫密閉,避光的自然發(fā)酵方式;考馬斯亮藍(lán)G250、重蒸酚 上海長(zhǎng)哲生物科技有限公司;混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(含Asp、Glu、Met、Tyr、Phe等17種氨基酸)、GABA 色譜純,日本和光純業(yè)工業(yè)株式會(huì)社;檸檬酸鈉(2H2O)、氫氧化鈉、氯化鈉、茚三酮 優(yōu)級(jí)純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;丙二醇單甲基醚、無(wú)水醋酸鈉、乙醇、冰醋酸 色譜純,阿拉丁試劑有限公司;純凈水 娃哈哈集團(tuán)。

KQ-300E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海邁源環(huán)境實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;PTX-FA210型電子天平 福州華志科學(xué)儀器有限公司;JT-DCY-12Y型水浴氮吹儀 杭州聚同電子有限公司;Allegra X-12R型離心機(jī) 貝克曼庫(kù)爾特有限公司;L-8900型氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 草莓酵素的制備 采用程勇杰[8]等的方法。用滅菌好冷卻后的無(wú)菌水輕洗草莓樣品表面,常溫下自然瀝干。瀝干后去蒂直接切成薄片,按草莓和糖液(w∶w=3∶4)30 kg快速加入高壓蒸汽滅菌過(guò)的發(fā)酵罐,加入10%(v/v)的酵素菌液(菌體濃度:1×105CFU/mL),密閉、25 ℃室溫避光發(fā)酵。實(shí)驗(yàn)3次平行。定時(shí)取一定量發(fā)酵液,在6000 r/min轉(zhuǎn)速下離心15 min,取上層清液于-85 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。樣品發(fā)酵取樣時(shí)間分別為10、20、30、50、75、110、140、155 d。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)G250法[15]測(cè)定發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量。準(zhǔn)確稱(chēng)取考馬斯亮藍(lán)G250試劑100 mg,溶于50 mL 95%乙醇,加入85%(w/v)磷酸,用水稀釋至1000 mL備用,利用牛血清白蛋白制備標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性方程y=0.0055x+0.064,R2=0.9994。實(shí)驗(yàn)前取出冷凍后的草莓酵素,與30 ℃水浴30 min,取200 μL草莓酵素,加水至1000 μL,然后加入5 mL配制好的考馬斯亮藍(lán)G250溶液,混勻,靜置反應(yīng)10 min,以去離子水做空白對(duì)照,在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 樣品前處理和氨基酸分析 用酸水解法進(jìn)行樣品處理[16]:取冷凍后于30 ℃水浴30 min后的草莓酵素1 mL于水解管中,加入HCl∶H2O=1∶1(v/v)的HCl溶液10 mL,重蒸酚175 μL,振蕩混勻,在冰水浴中冷卻5 min后吹入氮?dú)獗Ｗo(hù),于110 ℃數(shù)顯恒溫鼓風(fēng)干燥箱中水解22 h。水解液經(jīng)冷卻,過(guò)濾、沖洗、定容至50 mL容量瓶中。再取2 mL濾液,45 ℃真空干燥,完畢后,加入1 mL去離子水同條件再次烘干,加入1 mL 0.02 mol/L檸檬酸鈉緩沖液,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,等待上機(jī)進(jìn)樣。

氨基酸分析儀操作條件參照GB 5009.124-2016[17],流動(dòng)相:檸檬酸鈉緩沖溶液,控制流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;分離柱柱溫:57 ℃;反應(yīng)柱柱溫:135 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):脯氨酸檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm,其它氨基酸檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm。以峰面積作為檢測(cè)結(jié)果,采用外標(biāo)法計(jì)算氨基酸濃度。

1.2.4 氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與風(fēng)味評(píng)價(jià) 采用1973年FAO/WHO建議的氨基酸評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)[18-20],評(píng)價(jià)范圍包括氨基酸評(píng)分(Amino acid score,AAS)、氨基酸比值(ratio of amino acid,RAA)、氨基酸比值系數(shù)(ratio coefficient of amino acid,RC)、比值系數(shù)分(score of ratio coefficient of amino acid,SRC)。具體計(jì)算方法如下,

氨基酸得分(AAS)(%)=[某必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]/[FAO/WHO模式中該必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]×100

氨基酸比值(RAA)(%)=[某必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]/[模式中該必需氨基酸含量(g/100 g粗蛋白)]×100

SRC=100-CV×100

氨基酸風(fēng)味成分按照氨基酸含量用味覺(jué)閥值比[21]來(lái)分析,評(píng)價(jià)指標(biāo)為含量閥值比(ratio of content and taste threshold,RCT)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)不同參數(shù)進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)n=3,氨基酸含量取3次實(shí)驗(yàn)平均值,氨基酸組成評(píng)價(jià)與蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。蛋白質(zhì)、必需氨基酸和GABA含量變化采用Origin 8.6繪圖,氨基酸聚類(lèi)分析采用SPSS 18.0處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)含量變化

圖1是不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢(shì),在發(fā)酵的前20 d,幾乎檢測(cè)不到蛋白質(zhì)。在20～30 d,蛋白質(zhì)含量迅速上升,在此時(shí)間范圍內(nèi),充足的糖分和原料本身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),使微生物大量繁殖代謝生成蛋白質(zhì),同時(shí)原料中的蛋白質(zhì)隨著發(fā)酵的進(jìn)行,也會(huì)浸漬到發(fā)酵液中。在30～75 d,蛋白含量呈緩慢增加的趨勢(shì),至75 d含量達(dá)到最高,為137.68 μg/mL,隨后蛋白質(zhì)含量有所下降,在第110 d降至103.03 μg/mL,然后再呈緩慢增加的趨勢(shì)。袁周率等[7]通過(guò)對(duì)糙米酵素發(fā)酵前后糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、氨基酸等研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵前后可溶性糖從4.62%降至4.34%,蛋白質(zhì)含量從0.51%升至0.58%。陳燕飛[22]指出,微生物在低滲透壓食品中容易生長(zhǎng),在高滲透壓下易于脫水死亡,只有少數(shù)酵母可耐受高滲透壓環(huán)境。故發(fā)酵前期,微生物在高濃度糖漿造成極高的滲透壓下難以生長(zhǎng)繁殖,發(fā)酵液中可溶性蛋白質(zhì)含量較少。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),草莓本身的水分滲出,充足的糖分和原料本身的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),微生物開(kāi)始快速利用豐富的碳源生長(zhǎng)繁殖。蔣增良[23]通過(guò)研究樹(shù)莓發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)的含量變化發(fā)現(xiàn),發(fā)酵前64 d,蛋白質(zhì)含量一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì),在0～40 d增長(zhǎng)了近兩倍,增長(zhǎng)速率最快。后期由于微生物對(duì)糖類(lèi)物質(zhì)的利用和次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累導(dǎo)致部分微生物和細(xì)胞分解成小分子物質(zhì),蛋白質(zhì)含量下降。110 d后,發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)含量輕微上升,可能是微生物對(duì)原料本身進(jìn)行分解,導(dǎo)致原料蛋白質(zhì)逐漸溶出或菌體自溶所致。

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素發(fā)酵液中的可溶性蛋白質(zhì)含量Fig.1 Soluble protein content in strawberry jiaosu at different fermentation times

2.2 草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量變化

2.2.1 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸組分變化 為考察自動(dòng)氨基酸分析儀檢測(cè)方法的線性關(guān)系,準(zhǔn)確配制了濃度分別為2、5、20、50和100 nmol/mL的17種氨基酸和GABA混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。圖2為18種氨基酸(含GABA)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜,一通道(570 nm)下氨基酸在32 min內(nèi)全部分離出,GABA出峰時(shí)間為21.55 min;二通道(440 nm)脯氨酸(Pro)在8 min前出峰完全。結(jié)果表明18種氨基酸分離效果良好。以峰面積為縱坐標(biāo),各種氨基酸濃度為自變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性關(guān)系良好,各相關(guān)系數(shù)均大于0.99,如表1所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)混合氨基酸圖譜Fig.2 Chromatogram of standard amino acids

表1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curves of amino acids

采用外標(biāo)法分析和計(jì)算不同發(fā)酵時(shí)間的草莓酵素樣品中氨基酸含量,結(jié)果表明在發(fā)酵過(guò)程中檢出的氨基酸包括天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、GABA、賴(lài)氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro),其中含量最高的2種氨基酸分別為Glu和Asp,而甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)和組氨酸(His)未檢出。由于采用強(qiáng)酸對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)和多肽水解時(shí),水解過(guò)程中色氨酸(Trp)遭到破壞[24],因此在本方法下,草莓酵素中的Trp均未被檢測(cè)到。

表2是草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中各氨基酸組分含量變化情況,在發(fā)酵第10 d,發(fā)酵液中總氨基酸(不含GABA)含量較低,僅為0.288 mg/mL。發(fā)酵至10～30 d,總氨基酸含量迅速升至0.471 mg/mL。在發(fā)酵第30～140 d,總氨基酸含量呈總體平穩(wěn)并緩慢增加。在草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中,含量最高的2種氨基酸分別為Glu和Asp,發(fā)酵至第10 d,2種氨基酸的含量為0.101和0.105 mg/mL,分占總氨基酸含量的35.43%和36.65%,兩者總和接近總氨基酸含量的3/4,而兩種氨基酸在后續(xù)的發(fā)酵過(guò)程中含量無(wú)明顯變化。在人體內(nèi),Glu可與血氨結(jié)合形成谷氨酰胺,有利于肝臟的解毒功能,同時(shí)也可活躍人體的腦組織代謝,而Asp可緩解骨骼和牙齒的損害。一般而言,在草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中Cys含量較為穩(wěn)定,而Tyr在發(fā)酵第30 d才被檢測(cè)到,其它檢測(cè)到的氨基酸均呈先上升,再趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。姜遠(yuǎn)茂[25]等對(duì)哈達(dá)和豐香等4種草莓的氨基酸含量分析,發(fā)現(xiàn)四種草莓中Asp和Glu含量均最高,這也與草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中觀察到的主要氨基酸結(jié)果相一致。石彥國(guó)[26]等也指出草莓原料中Asp含量高達(dá)176 mg/100 g,因此發(fā)酵液中的Glu、Asp可能與草莓原料本身的溶出有關(guān)。袁周率[7]通過(guò)對(duì)糙米酵素發(fā)酵前后氨基酸含量研究發(fā)現(xiàn),發(fā)酵后部分氨基酸含量有所上升,其中Ala上升了17.74%。

表2 草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量變化(mg/mL)Table 2 Change of amino acid content in ferment of strawberry jiaosu(mg/mL)

2.2.2 發(fā)酵過(guò)程氨基酸種類(lèi)特性的聚類(lèi)分析 對(duì)草莓酵素不同發(fā)酵時(shí)間氨基酸的聚類(lèi)分析結(jié)果如圖3所示,其中1～8分別代表發(fā)酵時(shí)間為10、20、30、50、75、110、140和155 d。由圖3可知,根據(jù)發(fā)酵時(shí)間,可將氨基酸聚類(lèi)為四類(lèi)。即第1類(lèi):10 d,第2類(lèi):20 d,第3類(lèi):30、50、75 d,第4類(lèi)是110、140、155 d。聚類(lèi)分析的結(jié)果代表著不同發(fā)酵時(shí)間,氨基酸含量從極低到緩慢增加,再到趨于穩(wěn)定的總趨勢(shì),與利用氨基酸分析儀得到的不同發(fā)酵時(shí)間氨基酸變化趨勢(shì)結(jié)果相一致。

圖3 草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中氨基酸變化時(shí)間特征聚類(lèi)圖Fig.3 Characteristic clustering of amino acid change in different fermentation times of strawberry jiaosu

2.2.3 草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中GABA的變化 如圖4所示,發(fā)酵前20 d,GABA含量明顯上升,在發(fā)酵第20 d含量達(dá)到最高,為23.48 mg/L,隨之,含量急劇下降,在發(fā)酵第50 d,濃度降到2.27 mg/L。隨后又呈緩慢上升的趨勢(shì),發(fā)酵至155 d的含量與第10 d含量相接近。這有可能是發(fā)酵前期,在微生物分泌的蛋白酶作用下將蛋白質(zhì)水解,造成游離氨基酸如Glu等增多,而微生物(如乳酸菌)分泌的Glu脫羧酶催化谷氨酸合成GABA導(dǎo)致其濃度增加[27]。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中GABA含量變化Fig.4 Changes in GABA content during fermentation

2.3 草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中氨基酸營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)

2.3.1 草莓酵素中必需氨基酸含量 如圖5所示,在草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中必需氨基酸含量不斷上升,在發(fā)酵第10 d僅為0.024 mg/mL,發(fā)酵第30 d上升至第10 d的2倍。經(jīng)過(guò)155 d的發(fā)酵,必需氨基酸含量上升至0.104 mg/mL,相比發(fā)酵第10 d提高了3.33倍。呂春茂等[28]發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果渣發(fā)酵后必需氨基酸含量從0.87 mg/mL增加到5.33 mg/mL,從某種意義上來(lái)講,必需氨基酸含量與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有一定的相關(guān)性。

圖5 草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中必需氨基酸含量變化曲線Fig.5 Changes of the essential amino acid content in the fermentation process of strawberry jiaosu

2.3.2 草莓酵素中必需氨基酸組成評(píng)價(jià) 對(duì)于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的蛋白質(zhì),首先要求必需氨基酸種類(lèi)齊全,其次氨基酸之間的比例也同樣重要。合適的比例才能與人體需求相符合,必需氨基酸吸收更完全,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高[29]。將草莓發(fā)酵液中必需氨基酸與FAO/WHO模式氨基酸譜進(jìn)行對(duì)比,從而得出氨基酸得分,結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 草莓酵素中必需氨基酸組成評(píng)價(jià)Table 3 Composition evaluation of essential amino acid in strawberry jiaosu

其中AAS值越接近于1,蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高;AAS值小于1或大于1,分別表示為蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不足或營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩[30]。

由于在發(fā)酵的前20 d,蛋白質(zhì)含量較低,低于考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)的濃度極限,因此未對(duì)發(fā)酵10 d和20 d的發(fā)酵液進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)評(píng)估。發(fā)酵第30 d后,除Met外,其它8種必需氨基酸評(píng)分均>1,屬于較為嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩,特別是Thr和Cys。在草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中總氨基酸含量增加(如表2),總蛋白質(zhì)含量卻相對(duì)穩(wěn)定(如圖1),同時(shí)必需氨基酸所占總氨基酸比例增加,導(dǎo)致各種氨基酸得分相應(yīng)地增加。

2.3.3 草莓酵素蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià) 氨基酸比值[31]定義為一定量食物中氨基酸的含量相當(dāng)于模式氨基酸的倍數(shù)。RC用于判定限制氨基酸和計(jì)算限制氨基酸的強(qiáng)化量,可用模式氨基酸相當(dāng)量的一份樣品中氨基酸的比值來(lái)表示。如果樣品中氨基酸的組成與模式氨基酸模式相等,則RC等于1,同理,當(dāng)RC>1,則表示相應(yīng)氨基酸相對(duì)過(guò)剩,RC<1時(shí)表示相應(yīng)氨基酸相對(duì)不足。SRC主要用于蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的評(píng)價(jià)。理論上,SRC值越接近于100,蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值越高。

對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間草莓酵素RAA、RC和SRC進(jìn)行計(jì)算,結(jié)果如表4所示,第一限制氨基酸為酪氨酸(Tyr)+苯丙氨酸(Phe)。發(fā)酵30 d后,SRC值均高于55,尤其是發(fā)酵50 d后,在穩(wěn)定的微環(huán)境和較為穩(wěn)定的菌種活性條件下下,SRC值呈逐漸增加的趨勢(shì)。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值由高到低依次是:155 d>140 d>110 d>30 d>75 d>50 d,這一結(jié)果與氨基酸聚類(lèi)分析的第3類(lèi)和第4類(lèi)相一致。

表4 草莓酵素蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)Table 4 Nutritional evaluation of proteins of strawberry jiaosu

2.3.4 氨基酸風(fēng)味成分分析 天然氨基酸主要為L(zhǎng)構(gòu)型,而眾多的L型氨基酸是食品中新鮮口感的主要貢獻(xiàn)成分,如谷氨酸鹽作為食品調(diào)味劑已被人們使用多年。在草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中,分解產(chǎn)生的氨基酸和本身的游離氨基酸是影響草莓酵素風(fēng)味的主要因素。依據(jù)氨基酸的味覺(jué)強(qiáng)度,大致可將氨基酸分為鮮味氨基酸(Asp、Glu、Lys)、甜味氨基酸(Thr、Ser、Gly、Ala、His、Pro)、苦味氨基酸(Val、Met、Ile、Leu、Arg)和芳香族氨基酸(Cys、Tyr、Phe)[19]。

表5為草莓酵素4種不同風(fēng)味氨基酸在發(fā)酵過(guò)程中含量的變化趨勢(shì),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),鮮味氨基酸含量趨于穩(wěn)定;甜味氨基酸、芳香族氨基酸和苦味氨基酸含量不斷升高。尤其是苦味氨基酸,在發(fā)酵后期其含量是其它風(fēng)味氨基酸的幾十甚至上百倍。忽略在草莓酵素發(fā)酵過(guò)程中添加的糖類(lèi)物質(zhì)對(duì)風(fēng)味的影響,單純從氨基酸含量上來(lái)看,在發(fā)酵前期,影響草莓酵素風(fēng)味的物質(zhì)為鮮味氨基酸和苦味氨基酸;在發(fā)酵后期,主要是苦味氨基酸占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

表5 發(fā)酵過(guò)程中不同風(fēng)味氨基酸含量Table 5 Contents of different flavors of amino acids during fermentation

然而風(fēng)味氨基酸的含量與對(duì)酵素風(fēng)味貢獻(xiàn)并不一定呈嚴(yán)格的正相關(guān)性,這主要是由于不同氨基酸的味覺(jué)閥值不同,氨基酸濃度與味覺(jué)閥值的對(duì)比稱(chēng)為RCT[32]。RCT<1,氨基酸對(duì)風(fēng)味無(wú)貢獻(xiàn);只有當(dāng)RCT≥1時(shí),氨基酸才對(duì)風(fēng)味有貢獻(xiàn)。且RCT值越大,相應(yīng)氨基酸對(duì)食品的風(fēng)味貢獻(xiàn)越大。表6計(jì)算了草莓酵素在發(fā)酵過(guò)程中各種風(fēng)味氨基酸的含量閥值比,在發(fā)酵過(guò)程中,除Asp和Glu兩種鮮味氨基酸的RCT值大于1,其它15種氨基酸對(duì)發(fā)酵液的風(fēng)味均無(wú)明顯的貢獻(xiàn),說(shuō)明Asp和Glu兩種氨基酸對(duì)草莓酵素發(fā)酵液的風(fēng)味有主要貢獻(xiàn)。然而在發(fā)酵過(guò)程中,Asp和Glu的含量變化趨勢(shì)并不明顯,而且由表2可知2種氨基酸的含量在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中變化也不明顯。因此,從氨基酸角度講,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),草莓酵素的苦味、甜味、芳香等風(fēng)味變化不明顯,主要還是以鮮味為主要風(fēng)味。當(dāng)然,原料成分、微生物代謝產(chǎn)物的影響也可能會(huì)造成草莓酵素發(fā)酵液口感的變化。

表6 草莓酵素中各種風(fēng)味氨基酸的含量閥值比(RCT)Table 6 Threshold content ratio of each flavor amino acid in strawberry jiaosu(RCT)

3 結(jié)論

對(duì)草莓酵素蛋白質(zhì)和氨基酸含量及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值進(jìn)行分析,結(jié)果表明,蛋白質(zhì)含量在發(fā)酵前期明顯增加,發(fā)酵至75 d含量達(dá)到最高,為137.68 μg/mL,隨后緩慢降低,但相比發(fā)酵前有顯著提升(p<0.05)?？偘被岷颗c必需氨基酸含量也有較明顯提高,說(shuō)明一定時(shí)間的發(fā)酵能提高酵素中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量,且提高程度較明顯。GABA含量在發(fā)酵前20 d經(jīng)過(guò)急劇變化后,再經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的發(fā)酵,GABA含量與發(fā)酵前并無(wú)明顯差異,說(shuō)明發(fā)酵對(duì)GABA的消耗再后期可以得到彌補(bǔ)。草莓酵素中氨基酸較為齊全,營(yíng)養(yǎng)豐富,在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,SRC值始終高于55,且數(shù)值處于上升趨勢(shì)。由此可見(jiàn),適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間可有效提高草莓酵素的營(yíng)養(yǎng)均衡度。就氨基酸呈味發(fā)酵過(guò)程中只有Asp和Glu兩種鮮味氨基酸的RCT值大于1,對(duì)味覺(jué)有影響,但由于其它成分如有機(jī)酸和其它活性物質(zhì)的影響,發(fā)酵過(guò)程中氨基酸含量的變化對(duì)味覺(jué)的影響不大。