文 祎,王 振,蔡淑嫻,劉仲華,*

(1.國家植物功能成分利用工程技術研究中心,湖南長沙 410128; 2.湖南省植物功能成分利用協(xié)同創(chuàng)新中心,湖南長沙 410128; 3.湖南農業(yè)大學園藝園林學院,湖南長沙410128)

近年來的研究表明,慢性、免疫病理性炎癥對人體的傷害非常大,與很多疾病相關。日常飲食習慣、吸煙、肥胖、病毒感染等因素都可能會導致持續(xù)性低烈度系統(tǒng)炎癥,這些炎癥與心血管疾病、消耗性疾病、Ⅱ型糖尿病及腫瘤等疾病的發(fā)病危險率的顯著升高密切相關,也是炎癥性疾病如關節(jié)炎、哮喘等過敏癥的病因。因此,致力于有效抑制病理性的炎癥過程顯得尤為重要。

鐵觀音品種是烏龍茶中的主要優(yōu)良品種,素有“綠葉紅鑲邊,七泡有余香”的美稱[1]。隨著現(xiàn)代社會的發(fā)展,飲用和品嘗茶的消費者日漸增多,人們對茶的要求已逐漸從“溫飽型”轉向“美食型”和“保健型”。近年來,多項研究發(fā)現(xiàn),茶多酚對治療心血管炎癥有很好的療效,此外,茶多酚對骨關節(jié)炎、腸道炎、腎炎等[2]也具有顯著療效,其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)生物活性最強,抗炎效果最佳。鐵觀音中富含茶多酚、茶氨酸、咖啡堿等多種活性成分,使得茶葉具備多種有效的保健功能[3-4],如降血脂、降血糖、防輻射、抗腫瘤等[5-7],其潛在功效機制除與抗氧化作用有關外,還與其抗炎作用密切相關[4]。國內外對于茶葉活性成分單體抗炎作用的研究頗多,可對于茶葉水提物的抗炎功能研究甚少。

為了更全面地了解安溪鐵觀音的抗炎保健功能,本實驗以LPS誘導RAW264.7細胞建立炎癥模型[8],并用吲哚美辛和不同濃度鐵觀音提取物處理,檢測NO和IL-6的分泌情況,qPCR檢測一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶2(COX-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、白細胞介素6(IL-6)mRNA相對表達,Western Blot檢測炎癥相關蛋白激酶(IKKβ),核轉錄因子κB抑制因子(IκB)、核轉錄因子κBp65(NFκB p65)及其磷酸化產(chǎn)物的相對表達,探究鐵觀音的體外抗炎活性及機制,為其防治炎癥疾病、開發(fā)抗炎藥物提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

RAW264.7小鼠巨噬細胞 中國醫(yī)學科學院細胞中心;安溪鐵觀音 八馬茶業(yè)股份有限公司;N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈 國產(chǎn)分析純;兒茶素、沒食子酸、可可堿、茶堿標準品、LPS和吲哚美辛 Sigma公司;噻唑藍(MTT)、qPCR引物 上海生工生物公司;DMEM培養(yǎng)基 Gibco公司;胎牛血清 BI公司;SYBR premix EX Taq試劑盒、RNA反轉錄試劑盒 日本TakaRa公司;IKKβ、IκB、p65、p-IKKβ、p-IκB、p-p65蛋白抗體 CST公司;NO檢測試劑盒 碧云天試劑公司;總RNA提取試劑盒 全式金生物公司;IL-6ELISA試劑盒 博士德生物公司;HRP標記的二抗 Abcam公司;增強型ECL發(fā)光液 Engreen公司。

EL-131型旋轉蒸發(fā)濃縮儀 Buchi公司;GAMMA1-20真空冷凍干燥機 CHRIST公司;紫外分光光度計、LC-2010AHT高效液相色譜儀 Shimadzu公司;opticlean-1300超凈工作臺 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;CO2培養(yǎng)箱 Nuaire公司;倒置顯微鏡 Leica公司;Rotor-Gene Q熒光定量PCR儀、Varioskan Flash多功能酶標儀 賽默飛世爾科技公司;Rotina380普通離心機 Hettich公司;精密電子天平 Starorius公司;FluorChem FC2化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 南京非同科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵觀音茶提取物的制備 稱取鐵觀音茶樣50 g,加入500 mL沸水水浴加熱45 min,過濾后再加入250 mL沸水,水浴30 min,合并濾液經(jīng)冷凍干燥30 h制成茶粉,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鐵觀音茶提取物主要成分的測定 茶多酚的測定參照國家標準GB/T8313-2008;游離氨基酸的測定參照國家標準GB/T8314-2013;兒茶素組分、生物堿和沒食子酸含量的測定采用HPLC檢測法[9]。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與分組 處理RAW264.7小鼠巨噬細胞系用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)傳代,培養(yǎng)箱設置條件為37 ℃、5% CO2。將RAW264.7細胞接種于細胞培養(yǎng)皿上,培養(yǎng)24 h后進行分組處理,正常對照組:不做任何處理,正常培養(yǎng)24 h;炎癥模型組:1 μg/mL脂多糖(LPS)持續(xù)刺激細胞24 h;陽性對照組:1 μg/mL LPS和20 μg/mL吲哚美辛[10]共同處理細胞24 h;鐵觀音茶提取物處理組:1 μg/mL LPS和不同濃度鐵觀音茶提取物(50、100、200 μg/mL)共同處理細胞24 h。

1.2.4 鐵觀音茶提取物對RAW264.7細胞活力的影響 RAW264.7細胞以1×104/孔的密度接種于96孔板,按上述分組給藥,24 h后吸除上清液,每孔加入100 μL MTT(0.5 mg/mL)于培養(yǎng)箱內孵育4 h;再次吸除上清液,加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL/孔于搖床上輕晃10 min,酶標儀檢測吸光值(A490 nm)。根據(jù)公式計算細胞相對活力:細胞相對活力(%)=(處理組的吸光度/對照組吸光度)×100。

1.2.5 iNOS、COX2、TNF-α、MCP-1和IL-6基因表達的測定 提取各組細胞的總RNA,逆轉錄合成cDNA,熒光定量qPCR檢測炎癥因子iNOS、COX-2、TNF-α、MCP-1、IL-6mRNA相對表達,引物利用primer軟件設計,并由上海生工生物技術公司合成,具體引物信息見表1。

表1 內參及目的基因熒光定量PCR反應的引物序列Table 1 Primer sequences of reference and target genes in qPCR reaction

熒光定量qPCR選用TaKaRa的SYBR premix EX Taq試劑盒,設置反應條件如下:95 ℃變性 10 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,重復反應40個循環(huán);95 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,95 ℃ 30 s。每個標本均作三個復孔,復孔間的Ct值差異控制在0.5以內,選用2ΔΔCt法計算表達水平。

1.2.6 NO的分泌和IL-6的表達情況RAW264.7細胞系以1.5×105個/孔的密度接種于24孔板,按照上述分組處理細胞,24 h后收集細胞上清液200 μL/孔,按NO試劑盒和IL-6ELISA試劑盒說明操作,測定細胞上清液中NO和IL-6含量。

1.2.7 Western blot蛋白免疫印記分析 按上述分組處理細胞,48 h后收集細胞并RIPA裂解提取總蛋白,BCA試劑盒檢測蛋白濃度并制成待測樣品。用4.8%～10% SDS-PAGE膠電泳、濕轉法轉膜,5%脫脂奶粉封閉60 min,隨后加入一抗(1∶1000)4 ℃孵育過夜,TBST洗滌三次后加二抗(1∶10000)于室溫孵育1 h,再次充分洗滌后,加入200 μL ECL化學發(fā)光液,FluorChem FC2化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)拍照,Image J軟件進行條帶灰度分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 鐵觀音茶提取物中主要活性成分及組分含量

由表2可知,鐵觀音茶提取物中,茶多酚含量最高,達總量的59.27%,其次是游離氨基酸、生物堿。沒食子酸和兒茶素是茶葉中多酚類物質的主要構成,鐵觀音茶提取物中沒食子酸含量為0.58%,兒茶素組分含量有一定的差異,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表沒食子兒茶素(EGC)單體含量最高,其中EGCG達18.19%。咖啡堿是生物堿的主要組成部分,占水提物總量的9.79%,占生物堿總量的98.8%以上,茶葉水提物中幾乎不含茶葉堿,可可堿含量甚微,主要原因可能是水提過程中咖啡堿極易浸出。

表2 鐵觀音茶提取物中主要活性成分及組分含量Table 2 Content of main active ingredients and components in Tieguanyin tea extract

2.2 鐵觀音茶提取物對RAW264.7小鼠巨噬細胞活力的影響

MTT法檢測結果顯示,鐵觀音茶提取物在50、100和200 μg/mL三個濃度劑量下,單獨作用或與LPS共同作用處理24 h后對RAW264.7細胞的相對活力均無明顯影響,表明在濃度范圍內,鐵觀音茶提取物對細胞無毒性作用(圖1)。

圖1 不同濃度鐵觀音茶提取物 對RAW264.7細胞相對活力的影響Fig.1 Effect of Tieguanyin tea extracts on thecell viability of RAW264.7 cells

2.3 鐵觀音茶提取物對LPS誘導RAW264.7細胞中炎癥因子的影響

LPS作為革蘭氏陰性菌細胞壁的一種特有成分,能誘發(fā)細胞的炎癥反應,在體外實驗中多采用LPS誘導RAW64.7細胞作為炎癥模型評價藥物的抗炎活性[11]。誘導性一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)是兩個重要的炎癥相關蛋白,在正常狀態(tài)下幾乎不表達,當炎癥發(fā)生時,細胞被活化,誘導iNOS和COX-2基因和蛋白表達,加劇炎性損傷[12]。如圖2所示,與正常對照組相比,模型組細胞中iNOS和COX-2 mRNA水平極顯著升高(p<0.01);與模型組相比,陽性藥物組和鐵觀音組均可明顯降低iNOS和COX-2 mRNA的表達水平,對COX-2的表達影響呈劑量依賴性,然而鐵觀音茶提取物對LPS誘導iNOS轉錄水平升高的抑制作用極顯著地弱于吲哚美辛(p<0.01)。

圖2 鐵觀音茶提取物對LPS誘導RAW264.7細胞中 iNOS和COX-2 mRNA相對表達的影響Fig.2 Effect of Tieguanyin tea extracts on the mRNA expressions of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells after LPS stimulation注:模型組與對照組相比,##p<0.01;藥物處理組 與模型組相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。

小鼠巨噬細胞RAW264.7在LPS的誘導下激活,合成并釋放出的大量炎癥介質,產(chǎn)生的炎性相關因子如TNF-α、MCP-1、IL-6等相互促進,使得炎癥反應進程加劇。如圖3所示,與正常對照組相比,模型組細胞中TNF-α、IL-6、MCP-1mRNA水平極顯著升高(p<0.01);陽性藥物和50、100、200 μg/mL鐵觀音均可降低LPS誘導的TNF-α、IL-6、MCP-1mRNA表達水平升高,且鐵觀音茶提取物的作用效果呈劑量依賴性,鐵觀音高劑量組對IL-6和MCP-1mRNA水轉錄抑制作用優(yōu)于吲哚美辛。本研究表明,鐵觀音茶取提物能夠下調TNF-α、MCP-1、IL-6等炎癥因子mRNA的表達,表明鐵觀音茶提取物能在基因水平抑制LPS誘導的巨噬細胞促炎因子的表達,具有很好的體外抗炎活性。

圖3 鐵觀音茶提取物對LPS誘導RAW264.7細胞TNF-α、 IL-6、MCP-1mRNA相對表達的影響Fig.3 Effect of Tieguanyin tea extracts on the mRNA expressions of TNF-α,IL-6 and MCP-1 in RAW264.7 cells after LPS stimulation

2.4 鐵觀音茶提取物對LPS誘導RAW264.7細胞后NO和IL-6分泌表達的影響

NO是一種重要的炎癥介導和調節(jié)因子,參與多種機體內的生理過程,如果長期處于高濃度狀態(tài)會引發(fā)機體許多疾病;小鼠巨噬細胞RAW264.7在LPS的誘導下釋放出的大量的促炎因子IL-6,IL-6的累積會使得炎癥反應進程加劇。如圖4所示,模型組細胞NO和IL-6的分泌均極顯著高于正常組(p<0.01);與模型組相比,三個濃度的鐵觀音茶提取物均顯著地抑制了RAW264.7細胞中NO和IL-6的分泌(p<0.05),且呈現(xiàn)出劑量依賴性,推測這可能與鐵觀音茶提取物能抑制環(huán)氧化酶信號途徑的活化有關。

圖4 鐵觀音茶提取物對LPS誘導的RAW264.7 細胞NO分泌及IL-6蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Tieguanyin tea extracts on the secretions of NO and IL-6 in RAW264.7 cells after LPS stimulation

2.5 鐵觀音茶提取物對NF-κB炎癥信號通路的影響

如圖5(A)所示,經(jīng)LPS(1 μg/mL)處理48 h后,細胞中IKKβ、IκB總蛋白無明顯變化,而p-IKKβ和p-IκB相對表達量極顯著升高(p<0.01),吲哚美辛和高濃度的鐵觀音茶提取物干預后,磷酸化產(chǎn)物p-IKKβ和p-IκB均極顯著降低(p<0.01),說明鐵觀音茶提取物能抑制NF-κB信號通路的激活,為了驗證這一點,繼續(xù)檢測p65和p-p65的蛋白表達,結果表明,高濃度鐵觀音茶提取物也能極顯著抑制p65發(fā)生磷酸化作用(p<0.01),實驗結果與茶葉活性成分抗炎的文獻報道基本一致[13-14],且高濃度鐵觀音茶提取物的抗炎活性強于20 μg/mL的陽性藥吲哚美辛。

圖5 鐵觀音茶提取物對LPS誘導RAW264.7細胞后磷酸化IKKβ、IκB、p65相對表達的影響Fig.5 Effect of Tieguanyin tea extracts on the phosphorylation of IKKβ,IκB and p65 in RAW264.7 cells after LPS stimulation

3 討論與結論

NO和IL-6是參與炎癥反應的兩個重要炎性介質,炎癥發(fā)生時釋放大量的NO和IL-6。NO的表達是通過其上游關鍵酶iNOS來控制的。本研究表明鐵觀音茶提取物能顯著抑制LPS誘導RAW264.7 細胞NO和IL-6的釋放(p<0.05),并進一步檢測了鐵觀音茶提取物對NO的上游關鍵酶iNOS mRNA表達及促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA表達的影響,結果表明,鐵觀音茶提取物對NO和IL-6等炎癥因子的表達抑制是通過下調炎癥相關蛋白iNOS和COX-2的基因表達和促炎因子IL-6、TNF-α、MCP-1的基因表達來實現(xiàn)的,且高濃度時抑制效果極顯著(p<0.01)。

NF-κB信號通路是LPS刺激RAW264.7細胞產(chǎn)生炎癥因子下游的一條重要通路,與促炎性酶如iNOS和COX-2等的表達及炎性細胞因子IL-6、TNF-α、MCP-1等的合成分泌密切相關。如圖6所示,NF-κB是基因調控的炎癥疾病中重要的核轉錄因子,蛋白家族包括p65、p50等,當NF-κB與NF-κB抑制蛋白IκB結合在一起時,細胞處于靜息狀態(tài)存在,細胞受到外界信號LPS刺激時,IκB發(fā)生磷酸化或泛素化被IκB激酶IKK降解,NF-κB核定位序列暴露,隨之游離出來進入細胞核,并與其靶基因上游調控序列相結合,啟動包括iNOS、IL-6、TNF-α、MCP-1、COX-2等炎癥介質的轉錄與表達。

圖6 鐵觀音茶提取物對NF-κB信號轉導通路的調節(jié)作用Fig.6 Regulation of Tieguanyin tea extracts on NF-κB signaling pathways注:鐵觀音茶提取物┤指鐵觀音茶提取物具下調或抑制作用。 鐵觀音茶提取物可有效抑制IKK、IκB和NF-κB p65 磷酸化來阻斷NF-κB的激活,使其發(fā)揮顯著的抗炎功效。

鐵觀音茶提取物含有大量的茶多酚、氨基酸和生物堿,而這些活性成分在很多體外細胞實驗和體內動物實驗中,已被證實可通過抑制NF-κB通路的激活而表現(xiàn)出來一定程度的抗炎功效[8,15-16]。本實驗發(fā)現(xiàn),鐵觀音茶提取物也是通過抑制NF-κB信號通路發(fā)揮作用,即抑制上游蛋白IKKβ和IκB的磷酸化,減少NF-κB p65蛋白的激活,進而減少NF-κB p65與靶基因結合后產(chǎn)生釋放各種炎癥因子,從而發(fā)揮顯著的抗炎作用,且高濃度鐵觀音茶提取物的抗炎活性強于20 μg/mL的陽性藥吲哚美辛。

本論文只是單一的從體外方面研究了鐵觀音茶提取物的抗炎作用和機制,仍需有進一步的動物實驗進行驗證,且在分子作用機制的研究中未檢測NF-κB p50等蛋白的表達和NF-κB核轉位情況,因此還需進一步加深研究以便充分開發(fā)鐵觀音茶提取物的抗炎活性。綜上所述,本實驗探討鐵觀音茶的抗炎作用,并初步闡明了其抗炎作用機制,這對今后炎癥相關疾病的研究、防治及開發(fā)具有抗炎作用的藥物等具有參考意義。