鄧邦蓮，陳雪峰，孟 蕾，易子安，秦 文，劉 龑，宋 爽，彭 超，巨妍靜

隨著納米技術(shù)的高速發(fā)展，越來越多的納米材料應(yīng)用于生物成像和生物載藥等生命科學(xué)領(lǐng)域。碳量子點(carbon dots，CDs)是一種新型的熒光納米材料，以碳原子為基本結(jié)構(gòu)單元，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同分為球狀結(jié)構(gòu)的碳納米點(carbon nanodots，CNDs)，具有單層或多層片狀結(jié)構(gòu)的石墨烯量子點(graphene quantum dots，GQDs)，或聚集顆粒狀的聚合物點(polymer dots，PDs)[1]。其中，GQDs不僅具備了CNDs的優(yōu)點，如：發(fā)光性能好、水溶性佳、毒性低、生物相容性優(yōu)異，同時兼具了石墨烯材料的特性，如高比表面積、表面官能團(tuán)豐富等[2, 3]。由于GQDs獨特的性能，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生物成像、傳感、生物載藥等多個技術(shù)領(lǐng)域[4-6]。

目前研究主要集中于新的合成方法以提高GQDs的產(chǎn)率、表面修飾與改性、腫瘤細(xì)胞成像等方面，對于其在神經(jīng)示蹤及生物毒性的研究較少。GQDs對神經(jīng)細(xì)胞的成像效果如何，目前研究尚淺。本研究擬通過構(gòu)造GQDs與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)的模型，探究不同粒徑的GQDs在PC12細(xì)胞中的細(xì)胞成像效應(yīng)及細(xì)胞毒性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 主要材料：15 nm與50 nm GQDs由南京先豐納米材料科技有限公司提供。PC12細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。主要試劑：澳洲胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)液、PBS緩沖液(Gibco，美國)； 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)(Sigma-Aldrich，美國)；CCK-8細(xì)胞增殖毒性檢測試劑盒(Dojindo，日本)；多聚甲醛 (廣州塞拉芬生物科技有限公司)

1.2 主要儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜(ESCO，新加坡)；醫(yī)用冷藏冰箱(青島海爾特種電器有限公司)；超低溫冰箱(KALTIS，美國)；超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；三用恒溫水箱(金壇市杰瑞爾電器有限公司)；微量加樣器(1-1000 μL)(eppendorf，德國)；M5多功能酶標(biāo)儀(MDS，美國)；馬爾文動態(tài)光散射儀(Malvern Instruments，英國)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 GQDs的表征 采用動態(tài)光散射法(DLS)對GQDs的水合粒徑和zeta電位進(jìn)行測定，測定條件為25 ℃，散射角173°，折射率1.33，激光波長633 nm。

1.3.2 PC12細(xì)胞的傳代與培養(yǎng) 實驗前進(jìn)行超凈臺、實驗器材消毒和實驗試劑預(yù)熱等準(zhǔn)備工作。配置含10% FBS、1%雙抗的完全培養(yǎng)液用于培養(yǎng)細(xì)胞，將其置于37 ℃、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)及培養(yǎng)液的顏色，光鏡下健康的PC12細(xì)胞貼在培養(yǎng)平底，呈長梭形，培養(yǎng)液清亮無雜質(zhì)。平均2 d進(jìn)行細(xì)胞換液，當(dāng)細(xì)胞生長面積占培養(yǎng)瓶面積80%左右時，進(jìn)行細(xì)胞傳代。將舊培養(yǎng)液棄掉，加入預(yù)熱的PBS緩沖液潤洗細(xì)胞1～2次，棄掉PBS緩沖液后，加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞消化5 min，直至顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓將要分離，加入完全培養(yǎng)液終止消化。使用移液器將培養(yǎng)瓶底的細(xì)胞吹打脫落，吹打均勻后，將細(xì)胞懸液置于15 ml離心管中，1000 r/min，離心5 min，棄上清，向離心管中加入完全培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞。根據(jù)實驗所需，將細(xì)胞按照1∶3或1∶4稀釋至新的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃ 、5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3 不同粒徑GQDs對PC12細(xì)胞系的增殖-毒性檢測 (1)實驗分組：空白對照組，不含細(xì)胞和實驗材料的培養(yǎng)液；陰性對照組，含有細(xì)胞和培養(yǎng)液，不含實驗材料；實驗組，含有細(xì)胞、培養(yǎng)液和不同濃度的GQDs懸浮液，設(shè)置8個劑量濃度，分別是20、40、80、120、160、200、250、500 μg/ml。2個時間點：24 h、48 h。每組設(shè)置6個復(fù)孔。(2)CCK-8法測定細(xì)胞毒性步驟:收集處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將按照5×103每孔的密度加入96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞貼壁及生長情況，棄去96孔板中原培養(yǎng)液，按照實驗設(shè)計加入不同濃度含GQDs的細(xì)胞培養(yǎng)液，將96孔板放入培養(yǎng)箱中孵育24、48 h。在各檢測時間點移除 96 孔板內(nèi)的原有培養(yǎng)液，每孔加入預(yù)先配置的CCK-8檢測液100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)30 ～60 min，在多功能酶標(biāo)儀OD 450 nm處測量各孔的吸光度值。計算細(xì)胞相對存活率，計算公式如下：細(xì)胞相對存活率(Survive rate)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%，其中As為實驗孔OD值，Ac為對照孔OD值，Ab為空白孔OD值。

1.3.4 不同粒徑GQDs對PC12細(xì)胞系的熒光成像檢測 收集處于對數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，將按照5×104每孔的密度加入共聚焦皿中，每孔2 ml，將共聚焦皿置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24 h。觀察細(xì)胞貼壁及生長情況，棄去皿中原培養(yǎng)液，加入含250 μg/ml GQDs的細(xì)胞培養(yǎng)液，將共聚焦皿放入培養(yǎng)箱中孵育1 h。棄去共聚焦皿內(nèi)原有培養(yǎng)液，PBS潤洗2～3次。加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS潤洗3次，共聚焦顯微鏡下觀察熒光成像效果。

2 結(jié) 果

2.1 不同粒徑GQDs的水合粒徑和zeta電位檢測 原始粒徑15 nm的GQDs在去離子水中的水合粒徑為(100.2±13.7)nm，zeta電位為+13.6 mV；原始粒徑50 nm的GQDs在去離子水中的水合粒徑為(187.6±17.5)nm，zeta電位為+11.4 mV；原始粒徑15 nm的GQDs在去離子水中的水合粒徑小于50 nm的，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 不同粒徑GQDs對PC12細(xì)胞的增殖-毒性檢測 CCK-8檢測結(jié)果表明，在24 h時間點，15 nm的GQDs對PC12細(xì)胞基本無毒性作用，各濃度干預(yù)后，細(xì)胞活力均保持在80%以上，而500 μg/ml的50 nm GQDs明顯降低了PC12細(xì)胞活力(P<0.05)。當(dāng)干預(yù)時間達(dá)48 h時，濃度小于200 μg/ml的GQDS對PC12細(xì)胞活力基本無影響，隨著GQDs作用濃度的增高，500 μg/ml的15 nmGQDs使細(xì)胞活力降至80%以下。50 nm的GQDS對PC12細(xì)胞表現(xiàn)出更明顯的細(xì)胞毒性，濃度高于250 μg/ml后，細(xì)胞活力明顯下降(圖1)。

圖1 不同粒徑的石墨烯量子點對PC12細(xì)胞活力的影響

2.3 不同粒徑GQDs對PC12細(xì)胞的熒光成像效應(yīng) 兩種粒徑的GQDs都能被PC12細(xì)胞攝取，但是PC12細(xì)胞對15 nm的GQDs攝取得更多，80%以上的細(xì)胞都被成功顯影，表現(xiàn)出明亮的熒光(圖2)。

圖2 不同粒徑的石墨烯量子點對PC12細(xì)胞的成像效應(yīng)(×100)

3 討 論

材料的理化性質(zhì)是影響其與細(xì)胞相互作用的關(guān)鍵因素。GQDs的表征結(jié)果表明，GQDs帶正電荷，且15 nm粒徑的GQDs表面電荷大于50 nm粒徑的GQDs。由于本研究采用GQDs混懸液的方式與PC12細(xì)胞相互作用，故GQDs在水溶液中的粒徑分布十分重要，50 nm的GQDs的水合粒徑明顯大于15 nm的GQDs的水合粒徑。本研究結(jié)果表明，GQDs在溶液中有一定程度的聚合，聚合作用會影響材料與細(xì)胞的相互作用[7]，因此，處理細(xì)胞前應(yīng)對材料進(jìn)行分散，降低聚合作用對實驗結(jié)果的影響。

隨著GQDs在生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，同時人們開始擔(dān)心其對機(jī)體的毒害作用。雖然目前大部分研究認(rèn)為，GQDs對機(jī)體的毒性作用較低，但仍有部分學(xué)者對此持有否定的觀點。Markovic等[8]報道，GQDs能誘導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞產(chǎn)生活性氧ROS，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，而且進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞自噬反應(yīng)及凋亡的發(fā)生。另一項研究指出，GQDs的長期暴露能導(dǎo)致秀麗隱桿線蟲運動頻率的下降、頭部和咽部的異常動作，反映了GQDs對多巴胺和谷氨酸神經(jīng)元的慢性毒性[9]。CCK-8檢測結(jié)果反應(yīng)，15 nm的GQDs對PC12細(xì)胞無明顯毒性，50 nm的GQDs的細(xì)胞毒性也較低，然而隨著干預(yù)濃度的增加和干預(yù)時間的延長，仍然展現(xiàn)出一定的毒害作用。本研究的結(jié)果與文獻(xiàn)[10, 11]報道的結(jié)果一致，GQDs的毒性較低，是一種生物安全性較好的納米材料，未來需要更完善的體內(nèi)與體外研究來進(jìn)一步確定GQDs的生物安全性。

GQDs由于其優(yōu)秀的發(fā)光性能，良好的生物相容性，被應(yīng)用于生物成像方面。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果表明，15 nm和50 nm的GQDs都能被PC12細(xì)胞攝取，且發(fā)出明亮的熒光，成功顯影PC12細(xì)胞，但是15 nm的GQDs表現(xiàn)出更優(yōu)秀的細(xì)胞成像效應(yīng)。Eda等[12]研究發(fā)現(xiàn)，GQDs的光學(xué)性能是尺寸依賴性的，粒徑越小的GQDs光致發(fā)光強(qiáng)度越高。此外，GQDs的細(xì)胞成像效應(yīng)也與細(xì)胞對其的攝取率相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對納米顆粒的攝取與其粒徑、形狀、比表面積、表面電荷和表面修飾等因素相關(guān)[13，14]。尺寸越小的納米顆粒更容易被細(xì)胞攝取[15]。此外，納米顆粒的表面電荷是影響細(xì)胞對其攝取的另一個重要因素[16]，研究發(fā)現(xiàn)，由于細(xì)胞膜表面帶有負(fù)電荷，相比起陰性電位的納米顆粒，陽性電位的納米顆粒更容易被吸附到細(xì)胞表面，甚至進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[17]。15 nm的GQDs表面帶的正電荷比50 nm的電荷高，因此更容易被細(xì)胞攝取。本實驗的結(jié)果表明，PC12細(xì)胞對GQDs的攝取是呈尺寸依賴性的，尺寸小的GQDs生物毒性低，更容易被細(xì)胞攝取，細(xì)胞成像效應(yīng)更好，更適合用于神經(jīng)系統(tǒng)生物成像。

綜上，本實驗探究了不同粒徑的GQDs在PC12細(xì)胞中的毒性與熒光成像效應(yīng)，結(jié)果證實，小粒徑的GQDs對PC12細(xì)胞的細(xì)胞毒性更低，更容易被細(xì)胞攝取，細(xì)胞成像效果更好。GQDs是一種合適的神經(jīng)示蹤材料，其在神經(jīng)系統(tǒng)的應(yīng)用與毒理研究需更進(jìn)一步的探究。