王金棟 朱守營(yíng) 王巒 田春艷 陸源建

食管癌切除術(shù)后有60%～80%的患者出現(xiàn)胃食管反流的癥狀[1]。24小時(shí)食管pH值檢測(cè)證實(shí)幾乎所有患者術(shù)后出現(xiàn)胃食管反流[2]，而且在臥位時(shí)更加嚴(yán)重。長(zhǎng)期反流可引起食管炎、Barrett食管以及再發(fā)食管癌[3]。為此，作者團(tuán)隊(duì)曾嘗試一種抗反流吻合手術(shù)方式即食管癌切除附加改良Nissen折疊術(shù)，并證實(shí)其具有抗反流的效果[4]。

環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一種催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的關(guān)鍵酶，參與組織細(xì)胞的調(diào)控，包括細(xì)胞增殖、血管發(fā)生以及抗細(xì)胞凋亡。有研究[5]發(fā)現(xiàn)食管黏膜上COX-2表達(dá)水平與食管遠(yuǎn)端酸暴露呈現(xiàn)正相關(guān)。在胃食管反流病的患者中，當(dāng)實(shí)施Nissen折疊術(shù)后，食管黏膜上COX-2及白介素-8基因表達(dá)可恢復(fù)到正常水平[6,7]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，作者團(tuán)隊(duì)采用實(shí)時(shí)定量PCR法觀察食管癌切除附加抗反流術(shù)后殘余食管上COX-2表達(dá)水平的變化，從基因水平觀察食管癌切除附加改良Nissen折疊術(shù)的抗反流效果。

對(duì)象與方法

一、 臨床資料

1. 病例來源：收集2013年12月—2015年7月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市立醫(yī)院胸外科治療的50例食管中下段癌患者，年齡51～73歲，平均59歲。①納入標(biāo)準(zhǔn)：病例選擇為食管中下段患者，吻合部位為食管胃弓上吻合。②排除標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)于食管上段癌患者，因預(yù)留殘余食管較短，難以附加改良Nissen折疊術(shù)，食管中段癌頸部吻合和食管下段癌行近端胃和弓下吻合病例均排除。

按照隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)原則將50例患者分為抗反流吻合組和常規(guī)吻合組，常規(guī)吻合組實(shí)施食管癌切除食管胃常規(guī)吻合術(shù)，抗反流吻合組在實(shí)施常規(guī)吻合基礎(chǔ)上附加改良Nissen折疊術(shù)。術(shù)后6個(gè)月～1年，42例患者參加術(shù)后隨訪，其中常規(guī)吻合組22例，抗反流吻合組20例。根據(jù)第8版食管鱗癌和食管腺癌國(guó)際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)患者進(jìn)行分期。以10名無反流癥狀的健康志愿者作為對(duì)照組，其中男性8名，女2名；平均年齡45歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、 方法

1. 手術(shù)方法：兩組患者均采用左胸后外側(cè)切口，游離食管和胃，切除部分食管和胃食管連接部。常規(guī)吻合組吻合部位位于胃底頂部的大彎側(cè)，食管胃端側(cè)器械吻合(WH-Y-24，常州華森醫(yī)療器械有限公司)，吻合后食管肌層和胃漿肌層縫合4針加固吻合口(圖1A)，胸腔胃縫縮呈胃管。抗反流吻合組吻合方式的示意圖見圖1B～D，充分游離食管及胃，切斷處距游離食管上緣4～5 cm(器械吻合需切除長(zhǎng)1～2 cm食管)，將胃底上提殘余食管后方，吻合部位選擇在胃前壁靠近胃大彎側(cè)、胃底最高點(diǎn)下3～4 cm處，行食管胃端側(cè)器械吻合(吻合器和常規(guī)吻合組相同)，將吻合口12點(diǎn)處胃底上提到殘余食管后方(吻合口上2～3 cm)，在食管肌層和胃底漿肌層縫合一針，然后將上提的胃底牽向殘余食管兩側(cè)，在殘余食管3點(diǎn)和9點(diǎn)處(同樣的高度)食管肌層和胃底漿肌層縫合兩針，向前包繞吻合口和殘余食管末2～3 cm和吻合口形成360°折疊。

圖1 食管癌切除常規(guī)吻合和附加改良Nissen折疊術(shù)示意圖。A：常規(guī)吻合；B～E：抗反流吻合

2. 胃鏡檢查：采用日本生產(chǎn)的OLYMPUS GIF-X0240電子胃鏡。觀察殘余食管和吻合口黏膜的形態(tài)、色澤、舒張度和有無病變，并在吻合口上3 cm處殘余食管黏膜上活檢標(biāo)本，分別在3、9、12點(diǎn)處各咬檢一塊。根據(jù)洛杉磯(LA)分類系統(tǒng)對(duì)反流性食管炎的嚴(yán)重程度進(jìn)行分級(jí)和評(píng)分[8]：A 級(jí)，局限于1條食管黏膜皺襞上，黏膜破損長(zhǎng)度≤ 5 cm(1 分)；B 級(jí)，局限于1條食管黏膜皺襞上，至少有1條黏膜長(zhǎng)度>5 cm，但2條黏膜皺襞破損間無相互融合(2 分)；C 級(jí)，2條或2條以上黏膜破損存在相互融合，但未累及食管全周(3 分)；D 級(jí)，融合為全周性的黏膜破損(4 分)；正常食管黏膜記為 0 分。

3. real-time PCR檢測(cè)：胃鏡下咬取標(biāo)本常規(guī)固定，按試劑盒(FFPET RNA Isolation Kit，Roche Applied Science Co.，Basel， Switzerland)的說明，提取目的RNA，用反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(Transcriptor first strand cDNA synthesis kit，Roche Applied Science Co.)合成cDNA。用ABI PRISM 7500型熒光定量PCR儀測(cè)定COX-2的表達(dá)，20 μl反應(yīng)體系包括cDNA模板，1 200 nmol引物和200 nmol TaqMan探針(表1)，0.4 IU AmpiTaq Gold DNA聚合酶，3.5 mmol MgCl2，1×Taqman緩沖液，反應(yīng)條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；然后再95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共46個(gè)循環(huán)。應(yīng)用real-time PCR平臺(tái)計(jì)算COX-2的相對(duì)表達(dá)量。

三、 術(shù)后隨訪

術(shù)后隨訪內(nèi)容包括胃食管反流癥狀問卷調(diào)查、胃鏡檢查、殘余食管黏膜活檢及活檢標(biāo)本COX-2的real-time PCR檢測(cè)。

四、 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、 基線資料比較

按第8版食管鱗癌和食管腺癌國(guó)際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)對(duì)腫瘤進(jìn)行分期，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，常規(guī)吻合組和抗反流吻合組患者在年齡、性別以及腫瘤發(fā)生的部位、組織學(xué)分型和TNM分期均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表2)。

表1 COX-2、β-actin 引物和TaqMan探針

表2 常規(guī)吻合組和抗反流吻合組基線資料比較[n(%)]

二、 反流性食管炎的發(fā)生情況

胃鏡檢查顯示兩組均有不同程度的反流性食管炎(圖2)，其中常規(guī)吻合組反流性食管炎的發(fā)病率為68.2%，抗反流吻合組發(fā)病率為45.0%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 1.729，P= 1.313)；但抗反流吻合組中嚴(yán)重反流性食管炎(C、D級(jí))明顯少于常規(guī)吻合組，抗反流吻合組反流性食管炎評(píng)分明顯低于常規(guī)吻合組[0.72±0.62)分vs(1.36±0.85)分，t=2.166，P=0.038]。

圖2 常規(guī)吻合組和抗反流吻合組反流性食管炎發(fā)生率

三、 COX-2 mRNA的表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)食管黏膜上COX-2基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示正常對(duì)照組COX-2 mRNA呈現(xiàn)低水平表達(dá)(0.062±0.039)，在兩組中胃鏡下檢查殘余食管黏膜正常的和殘余食管黏膜上發(fā)生反流性食管炎的COX-2 mRNA表達(dá)水平分別為0.135±0.073和0.161±0.124，均高于正常對(duì)照組(P<0.05)；但兩者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.137)(表3)。常規(guī)吻合組和抗反流吻合組COX-2 mRNA表達(dá)量均高于正常對(duì)照組(P=0.002和P=0.047)，而抗反流吻合組COX-2的表達(dá)量明顯低于常規(guī)吻合組(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

討 論

食管癌切除用胃重建消化道會(huì)引起胃內(nèi)容物和十二指腸液反流至殘余食管；此外，胸內(nèi)負(fù)壓和腹內(nèi)正壓的共同作用會(huì)促使反流物通過吻合口，因此食管癌術(shù)后胃食管反流是難以解決的問題，并且長(zhǎng)期存在，不隨時(shí)間延長(zhǎng)而減輕[2]。常規(guī)吻合口無抗反流作用，許多外科醫(yī)師嘗試采用改進(jìn)手術(shù)技巧和吻合方法減輕反流程度或防止反流發(fā)生。但有些手術(shù)雖然有效但操作復(fù)雜，未能得到廣泛應(yīng)用。

我們的手術(shù)方法是在食管胃器械吻合的基礎(chǔ)上，將胃底部包繞吻合口和殘余食管下端2～3 cm，試圖在該部位建立高壓帶，阻止胃食管反流發(fā)生，手術(shù)過程容易操作。我們?cè)捎檬彻軠y(cè)壓、24小時(shí)pH值監(jiān)測(cè)、胃鏡檢查多項(xiàng)客觀檢查綜合評(píng)價(jià)抗反流手術(shù)的效果。本研究結(jié)果表明，抗反流吻合組的胃食管反流程度明顯低于常規(guī)吻合組，意味著食管癌切除附加Nissen折疊術(shù)有抗反流效果，并且在吻合口上方殘余食管處出現(xiàn)高壓帶，起到類似食管下括約肌的作用，可能是減輕胃食管反流的原因[4]。

表3 殘余食管黏膜上發(fā)生反流食管炎和黏膜正常組與正常對(duì)照組COX-2 mRNA表達(dá)量比較

注：①殘余食管發(fā)生反流性食管炎組與正常對(duì)照組比較；②殘余食管發(fā)生反流性食管炎組與殘余食管黏膜正常組比較；③殘余食管黏膜正常組與正常對(duì)照組比較

表4 常規(guī)吻合組、抗反流吻合組和正常對(duì)照組COX-2 mRNA表達(dá)量比較

注：①常規(guī)吻合組與正常對(duì)照組比較；②常規(guī)吻合組與抗反流吻合組比較；③抗反流吻合組與正常對(duì)照組比較

本研究通過胃鏡觀察兩組患者術(shù)后殘余食管的形態(tài)改變，評(píng)估術(shù)后反流性食管炎的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。以往研究[9]顯示，反流性食管炎的發(fā)生不僅與胃食管反流物的發(fā)生有關(guān)，而且反流物的性質(zhì)、接觸時(shí)間、食管酸清除能力以及唾液在清除和中和酸性等方面是引起反流性食管炎的重要因素并影響其嚴(yán)重程度。我們以前的研究也顯示，酸反流(DeMeester評(píng)分)和十二指腸胃食管反流(膽紅素abs>0.14 時(shí)間百分比)的嚴(yán)重程度與反流性食管炎的評(píng)分具有相關(guān)性[10]，也就是說反流性食管炎評(píng)分也能間接反映反流程度。本研究結(jié)果顯示雖然抗反流吻合組反流性食管炎發(fā)生率和常規(guī)吻合組無明顯差異，但反流性食管炎評(píng)分明顯低于常規(guī)吻合組，而且嚴(yán)重反流性食管炎(C、D級(jí))發(fā)生率明顯低于常規(guī)吻合組，顯示食管癌切除附加抗反流吻合術(shù)具有抗反流效果，降低了反流性食管炎的嚴(yán)重程度；但抗反流吻合組還存在不同程度的反流性食管炎發(fā)生，說明改良Nissen抗反流吻合還未完全防止反流的發(fā)生。最近的文獻(xiàn)[11，12]報(bào)道，許多無癥狀的胃食管反流病患者或健康人群中，也存在非糜爛性食管炎，但胃鏡不能觀察到食管黏膜的損害，還需黏膜咬檢病理下證實(shí)，因此，胃鏡檢查還存在一定的偏差。

24小時(shí)pH值監(jiān)測(cè)是反應(yīng)胃食管反流的“金標(biāo)準(zhǔn)”，我們以前通過24小時(shí)pH值監(jiān)測(cè)也證實(shí)，食管癌附加改良Nissen折疊術(shù)具有抗反流效果，并試圖通過檢測(cè)基因表達(dá)的改變反應(yīng)胃食管反流程度的變化。胃食管反流可以誘發(fā)食管黏膜上諸多基因的表達(dá)[13]，并且有些基因表達(dá)出現(xiàn)在食管黏膜損害之前，在應(yīng)用抑酸藥物后，表達(dá)水平明顯下調(diào)，甚至下降至正常水平[14]，這意味著檢測(cè)胃食管反流病患者食管黏膜上基因的表達(dá)可以作為反應(yīng)胃食管反流發(fā)生的標(biāo)志物。本研究采用real-time PCR方法檢測(cè)殘余食管黏膜上COX-2 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)食管癌術(shù)后(常規(guī)吻合組和抗反流吻合組)殘余食管黏膜上有無發(fā)生反流性食管炎，以及COX-2 mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常人，但常規(guī)吻合組和抗反流吻合組無明顯差別，意味著COX-2 mRNA表達(dá)上調(diào)發(fā)生在食管黏膜改變之前，能夠預(yù)測(cè)胃食管反流的發(fā)生，可以作為提示反流發(fā)生的靈敏指標(biāo)。

COX-2表達(dá)不僅與遠(yuǎn)端食管酸暴露呈正相關(guān)，并且胃食管反流病患者在實(shí)施Nissen折疊術(shù)后，可以使遠(yuǎn)端食管黏膜上COX-2 mRNA的高表達(dá)恢復(fù)到正常表達(dá)水平[5,6]。本研究結(jié)果顯示，抗反流吻合組中殘余食管黏膜上COX-2 mRNA的表達(dá)水平明顯低于常規(guī)吻合組，表明胃食管反流程度的減輕可下調(diào)COX-2 mRNA的表達(dá)，COX-2 mRNA表達(dá)水平的降低可靈敏地反應(yīng)食管癌切除附加改良Nissen折疊術(shù)的抗反流效果。雖然抗反流吻合組中殘余食管黏膜上COX-2 mRNA的表達(dá)水平明顯下降，但還未達(dá)到正常食管黏膜上的水平，預(yù)示這種抗反流手術(shù)不能完全阻止反流的發(fā)生。因此，監(jiān)測(cè)食管黏膜COX-2 mRNA的表達(dá)可能會(huì)成為評(píng)估抗反流治療的一種新手段，并可能為研究反流性食管炎、Barrett食管以及食管腺癌的發(fā)病機(jī)制提供新思路。

近年來，微創(chuàng)食管癌根治術(shù)已成為安全、可行的手術(shù)方式，并且與傳統(tǒng)的手術(shù)方式相比患者術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率低、恢復(fù)快和生活質(zhì)量高[15]。食管代替物廣泛采用管狀胃(甚至細(xì)管胃)，文獻(xiàn)[16,17]報(bào)道應(yīng)用管狀胃重建食管和全胃相比較術(shù)后反流性食管炎發(fā)生率明顯降低，意味著管狀胃重建能減輕胃食管反流的程度，其原因可能與下列因素有關(guān)，第一，管狀胃縮小胃黏膜的面積使得胃酸分泌減少；第二，管狀胃使胃容積減小、胃容受性擴(kuò)張降低，進(jìn)食時(shí)胃內(nèi)壓力增加有助于胃排空[18]。然而，部分食管癌切除胃代食管手術(shù)患者出現(xiàn)胰十二指腸胃食管反流(膽汁反流)，并且與反流性食管炎發(fā)生密切相關(guān)[19]。因此，微創(chuàng)食管癌手術(shù)是否在吻合口處附加抗反流手術(shù)將是以后探索和研究的方向。

綜上所述，食管癌切除附加改良Nissen折疊術(shù)具有減輕胃食管反流的作用，檢測(cè)殘余食管黏膜上COX-2 mRNA的表達(dá)可能成為評(píng)估抗反流治療的新方法。由于本研究病例數(shù)有限，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在一定的偏差，仍需大宗病例和長(zhǎng)時(shí)間術(shù)后隨訪進(jìn)一步證實(shí)抗反流效果的有效性。