朱明宇 李雨珊 王志國

[摘要]目的：探究機械牽張力不同加載時間對誘導(dǎo)正常皮膚成纖維細(xì)胞（Normal skin fibroblasts， NSFB）向增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（Hypertrophic scar fibroblasts， HSFB）轉(zhuǎn)化的影響。方法：同一人體NSFB和HSFB分別設(shè)實驗組和對照組，實驗組加載0.1Hz、10%拉伸幅度的機械牽張力3d、5d、7d，對照組細(xì)胞均不加力。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力；SYBR Green qPCR法檢測細(xì)胞p130Cas、Integrin-β1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Ⅰ型膠原、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）mRNA表達水平；ELISA法檢測細(xì)胞上清液TGF-β1和Ⅰ型膠原含量；Western-blot法檢測細(xì)胞Integrin-β1、p130Cas、α-SMA蛋白表達水平。結(jié)果：機械牽張力加載5d時，NSFB實驗組與HSFB對照組比較，細(xì)胞增殖水平及p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA表達水平相近，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；加載3d、7d時，以上指標(biāo)檢測結(jié)果差異顯著，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：0.1Hz、10%拉伸幅度的機械牽張力加載5d可使NSFB表現(xiàn)出HSFB的部分生化特征，機械牽張力對NSFB向HSFB轉(zhuǎn)化過程有明顯的誘導(dǎo)作用。

[關(guān)鍵詞]增生性瘢痕；機械張力；成纖維細(xì)胞；細(xì)胞轉(zhuǎn)化

[中圖分類號]R619+.6 [文獻標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）06-0055-05

Abstract： Objective To investigate the effect of mechanical stretch at different loading times on the transformation of normal skin fibroblasts （NSFB） into hypertrophic scar fibroblasts （HSFB）. Methods The same demic NSFB and HSFB were respectively divided into the experimental groups and the control groups. The experimental groups were loaded with 0.1Hz， 10% amplitude cyclic stretch 3， 5 and 7 days. The control groups were cultured without cyclic stretch. CCK-8 method was used to measure the cell proliferation. SYBR Green qPCR method was used to measure the expression of p130Crk-associated substance （p130Cas） ， Integrin-β1， transforming growth factor β1 （TGF-β1） ， type I collagen and Alpha-smooth muscle actin（α-SMA） . ELISA method was used to measure the content of type I collagen and TGF-β1 in culture supernatant. Western-Blot method was used to detect the content of protein Integrin-β1， p130Cas and α-SMA. Results With 5-days-long amplitude cyclic stretch， cell proliferation and expression of p130Cas， Integrin-β1， TGF-β1， α-SMA and type I collagen of the NSFB experiment group showed no significant difference with that of the HSFB control group（P>0.05）. With 3-days-long and 7-days-long amplitude cyclic stretch， the above indexes showed significant differences （P<0.05）. Conclusion The mechanical tension loading of 0.1Hz and 10% tensile amplitude 5d can make NSFB exhibit some biochemical characteristics of HSFB， and the mechanical tension can obviously induce the transformation of NSFB to HSFB.

Key words： hypertrophic scar； mechanical stress； fibroblasts； cell transformation

皮膚損傷后，創(chuàng)面周圍的正常皮膚成纖維細(xì)胞（Normal skin fibroblasts， NSFB）增殖遷移，分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）使NSFB向增生性瘢痕成纖維細(xì)胞（Hypertrophic scar fibroblasts， HSFB）轉(zhuǎn)化，合成以Ⅰ/Ⅲ型膠原蛋白為主的細(xì)胞外基質(zhì)修復(fù)組織，并分泌α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）使組織內(nèi)纖維收縮，導(dǎo)致增生性瘢痕形成。臨床研究發(fā)現(xiàn)，切口張力與增生性瘢痕形成呈正相關(guān)，表明機械張力是導(dǎo)致增生性瘢痕形成的重要因素[1-2]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，加載機械牽張力后的成纖維細(xì)胞有表現(xiàn)出HSFB某些表型的趨勢。但是，由于缺乏相應(yīng)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞模型，機械張力誘導(dǎo)增生性瘢痕形成的具體機制尚未明確。前期研究表明，加載10%拉伸幅度的周期性機械張力時，NSFB會產(chǎn)生明顯的機械傳導(dǎo)效應(yīng)和生化反應(yīng)[3]，但加載時間對誘導(dǎo)NSFB向HSFB轉(zhuǎn)化過程的影響尚未明確。本實驗擬采用機械牽張力誘導(dǎo)NSFB向HSFB轉(zhuǎn)化，觀察不同機械牽張力加載時間對NSFB中各生化因子表達水平的影響，探究機械牽張力誘導(dǎo)NSFB向HSFB轉(zhuǎn)化的最佳加載時間，為增生性瘢痕形成機制研究進程奠定前期必要基礎(chǔ)，并提供重要實驗支撐。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器：MEM Eagle培養(yǎng)基（CORNING公司，美國）、FBS、含EDTA的胰酶（Gibco公司，美國）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒（同仁化學(xué)，日本）；TGF-β1、Ⅰ型膠原ELISA試劑盒（R&D; Systems公司，美國）；TRIzol試劑（Ambion公司，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）；Ⅰ型膠原、TGF-β1 、Integrin-β1、p130Cas、α-SMA及內(nèi)參GAPDH PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計合成；p130cas、Integrin-β1、α-SMA兔抗人單克隆抗體（Abcam公司，英國），山羊抗兔二抗（Abgent公司，蘇州），PVDF膜、ECL發(fā)光液（Millipore公司，美國）。

CO2培養(yǎng)箱（Panasonic公司，日本）；倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；多通道細(xì)胞應(yīng)力加載儀（BF-3001C；Flex-cell公司，美國）；6孔彈性基底膜培養(yǎng)板（BF-3001C；Flex-cell公司，美國）；酶聯(lián)免疫檢測儀（BioTek公司，美國）；ABI ViiA? 7 SYBR Green qPCR儀（ABI公司，美國）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ALPHA FCE公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組：瘢痕組織及正常皮膚部真皮組織均取自接受瘢痕切除植皮術(shù)（青島大學(xué)附屬醫(yī)院美容整形外科）的增生性瘢痕患者，共3例，患者本人均知情同意?；颊唏：劬性錾憩F(xiàn)，外觀呈紅色或深紅色，質(zhì)硬，高于周圍正常皮膚表面0.5cm以上，術(shù)前未進行抗腫瘤類藥物、激素類藥物或放射性治療；正常皮膚真皮組織均取自患者正常腹部皮膚，該處皮膚無紅腫，無硬結(jié)，無色素沉著。男1例，女2例，年齡分別為18、37、41歲。

按照文獻應(yīng)用組織塊法體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，取第3～8代細(xì)胞進行實驗。同一例患者NSFB和HSFB分別設(shè)實驗組和對照組。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×104個/ml，以2ml/孔均勻接種于6孔彈性基底膜培養(yǎng)板。于37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合度達30%后，更換培養(yǎng)基。根據(jù)前期研究皮膚成纖維細(xì)胞對10%拉伸幅度的機械張力產(chǎn)生最明顯的機械傳導(dǎo)及生化效應(yīng)[3]，設(shè)置加載機械張力參數(shù)為拉伸幅度10%，加力頻率0.1Hz，加力波形為正弦波。按加力儀說明書要求給予實驗組細(xì)胞連續(xù)加力4h后停止1h，以此循環(huán)，每日加力時間不少于10h，加載機械張力的總時間分為3d組、5d組和7d組；加力環(huán)境仍為37℃、5%CO2及飽和濕度。對照組不加力，其余培養(yǎng)條件與實驗組相同。每組實驗重復(fù)3次。實驗組和對照組細(xì)胞每隔2d每孔補充10%血清培養(yǎng)液0.5ml。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：4組分別于各時間點取3孔細(xì)胞，每孔加入CCK-8試劑200μl，輕搖培養(yǎng)板將試劑混勻后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h。分別取200μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置于96孔板中，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白孔，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處檢測吸光度值，以反映細(xì)胞數(shù)量。

1.3.2 ELISA法檢測TGF-β1、Ⅰ型膠原分泌量：收集各組培養(yǎng)板孔細(xì)胞上清液，按照TGF-β1、Ⅰ型膠原ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測TGF-β1、Ⅰ型膠原含量。

1.3.3 SYBR Green qPCR法檢測p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原的基因表達：各組取3孔細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，SYBR Green qPCR法檢測p130Cas、Integrin-β1、TGF-β1、α-SMA和Ⅰ型膠原的mRNA表達水平。具體操作如下：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10μl、PCR Forward Primer 0.8μl、PCR Reverse Primer 0.8μl、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4μl、滅菌蒸餾水6μl，cDNA溶液2μl，總體系20μl，每樣品重復(fù)3管；應(yīng)用ABI ViiA? 7 SYBR Green qPCR儀進行擴增，調(diào)整反應(yīng)條件，以95℃ 30s、95℃ 5s、60℃ 30s重復(fù)45個循環(huán)。擴增完成后，應(yīng)用ABI ViiA? 7軟件對反應(yīng)產(chǎn)物的熔解曲線進行自動定量分析。以GAPDH為內(nèi)參，各引物序列見表1。采用相對定量法計算各目的基因mRNA含量，即根據(jù)Ct值計算2-ΔΔct 值。ΔΔCt=（Ct目的-Ct內(nèi)參）-（Ct對照-Ct內(nèi)參）。

1.3.4 Western-Blot法檢測Integrin-β1、p130Cas、α-SMA蛋白表達量：各組取3孔細(xì)胞，將蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑按100：1的比例制成混合溶液，裂解細(xì)胞30min后，提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，測定后加入1/4樣品體積量的Loading Buffer，95℃金屬浴5min后室溫備用。調(diào)整電泳參數(shù)，濃縮膠80V 30min，分離膠120V、60min。取出凝膠后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜參數(shù)280mA 140min。Integrin-β1、p130Cas、α-SMA一抗稀釋濃度為1：5 000；內(nèi)參β-actin稀釋濃度1：1 500；二抗稀釋濃度1：10 000。一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1h后涂ECL發(fā)光液于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。用Image J圖像分析系統(tǒng)測定蛋白條帶的灰度值，以灰度值和條帶面積的乘積（IntDen）進行半定量分析。蛋白相對表達量=實驗組（IntDen目的-IntDen內(nèi)參）/對照組（IntDen目的-IntDen內(nèi)參）

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用S-N-Ka檢驗。P<0.05時認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性：加載機械牽張力1d時，HSFB細(xì)胞增殖水平高于NSFB；隨加載時間增加，各組細(xì)胞增殖能力增強，但實驗組細(xì)胞增殖水平均高于對照組。加載3d時，HSFB各組增殖水平高于NSFB各組；加載5d時，NSFB實驗組細(xì)胞增殖水平與HSFB對照組極為相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；加載7d時，NSFB實驗組細(xì)胞增殖水平與HSFB對照組存在明顯差距，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 不同時間機械牽張力對p130Cas、Integrin-β1蛋白及基因表達的影響：加載機械牽張力可使NSFB和HSFB的p130Cas、Integrin-β1表達水平提高；加載3d時，NSFB實驗組的p130Cas、Integrin-β1基因與蛋白表達水平低于HSFB對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；加載5d時，NSFB實驗組與HSFB對照組細(xì)胞p130Cas、Integrin-β1基因與蛋白表達水平極為接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；加載7d時，NSFB實驗組細(xì)胞p130Cas、Integrin-β1基因與蛋白表達水平高于HSFB對照組，明顯高于NSFB對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果顯示加載機械張力5d時，NSFB實驗組的P130Cas、Integrin-β1表達水平與HSFB對照組一致性最高。見圖2，表2～3。

2.3 不同時間機械張力對TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA基因和蛋白表達的影響：加載機械牽張力可使NSFB和HSFB的TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA表達水平提高；加載3d時，NSFB實驗組的TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA基因與蛋白表達水平低于HSFB對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；加載5d時，NSFB實驗組與HSFB對照組細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA基因與蛋白表達水平極為接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；加載7d時，NSFB實驗組細(xì)胞TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA基因與蛋白表達水平高于HSFB對照組，明顯高于NSFB對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明，在加載機械張力5d時，NSFB實驗組的TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA表達水平與HSFB對照組一致性最高。見圖3～5，表4。

3 討論

在機械牽張力、細(xì)胞因子、炎癥或感染等復(fù)雜因素作用下，創(chuàng)傷后組織容易形成增生性瘢痕。瘢痕愈合是機體修復(fù)一定程度的皮膚損傷的結(jié)果，主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞分泌以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)修復(fù)損傷組織，且愈合組織過度纖維增生，影響機體功能和美觀[4]。臨床研究明確了張力與增生性瘢痕形成的關(guān)系，張力大的切口易形成增生性瘢痕[2]；體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗研究發(fā)現(xiàn)，NSFB在機械牽張力作用下可表現(xiàn)出HSFB部分特征[5]。由于缺乏相應(yīng)的人類增生性瘢痕成纖維細(xì)胞模型，機械牽張力誘導(dǎo)增生性瘢痕形成具體機制研究進展緩慢。本研究對NSFB加載一定參數(shù)的機械牽張力，試圖將其誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為HSFB。

目前，細(xì)胞力學(xué)實驗已成為國內(nèi)外實驗研究的熱點，不同幅度、頻率及加載時間的機械牽張力可誘導(dǎo)多種細(xì)胞發(fā)生生化反應(yīng)及表型轉(zhuǎn)化，例如，加載頻率1Hz、20%拉伸幅度的機械牽張力時，血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子增多，血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生表型變化[6]；加載頻率1Hz、8%拉伸幅度的機械牽張力48h后，肌腱成纖維細(xì)胞增殖率最高，且此時細(xì)胞分泌較多的纖連蛋白及基質(zhì)金屬蛋白酶-1[7]；加載頻率1Hz、3%拉伸幅度的機械張力每天2次、每次1h，共3d，導(dǎo)致成骨細(xì)胞與肌腱成纖維細(xì)胞中參與骨整合與骨誘導(dǎo)的基因下調(diào)[8]。綜上所述，加載一定頻率、幅度及作用時間的機械牽張力會影響細(xì)胞的活性及生化反應(yīng)，這也是不同細(xì)胞承受機械張力的前期生物學(xué)研究基礎(chǔ)。目前對于誘導(dǎo)NSFB向HSFB轉(zhuǎn)化的張力參數(shù)并未明確，前期研究已證實，加載10%拉伸幅度的周期性機械張力時，NSFB產(chǎn)生明顯機械傳導(dǎo)效應(yīng)和生化反應(yīng)[3]，但尚不清楚誘導(dǎo)NSFB向HSFB轉(zhuǎn)化的加載時間參數(shù)。本研究的目的為探究誘導(dǎo)NSFB向HSFB轉(zhuǎn)化的最佳時間，為研究增生性瘢痕細(xì)胞模型提供科學(xué)、完整的重要標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)。

Integrin-β1、p130Cas是參與細(xì)胞內(nèi)機械牽張力傳導(dǎo)的重要分子。機械牽張力傳導(dǎo)的重要途徑是整合素（Integrin）信號通路，故細(xì)胞力學(xué)傳導(dǎo)能力主要體現(xiàn)在整合素信號通路中各分子的表達水平上。整合素信號通路傳導(dǎo)途徑為：在受到機械牽張力作用后，細(xì)胞膜上的整合素受體活化，促使細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白聚集形成黏著斑[9]，粘著斑向外與整合素結(jié)合[10]，向內(nèi)與細(xì)胞骨架感受器p130Cas相連[11]，通過其自身的形變將機械牽張力信號由細(xì)胞外傳導(dǎo)至細(xì)胞骨架[12]；細(xì)胞骨架又與細(xì)胞核膜相連，信號便通過細(xì)胞核膜上受體的傳導(dǎo)進入細(xì)胞核[13]；接收到信號的細(xì)胞核則在基因水平上調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生一系列生化反應(yīng)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)：雖然各組細(xì)胞的整合素和p130cas表達水平均與加載機械牽張力時間成正相關(guān)，但在加載機械牽張力5d時，NSFB內(nèi)整合素和p130cas表達水平已相當(dāng)接近未加載的HSFB內(nèi)水平，這表明當(dāng)加載機械牽張力5d時NSFB在力學(xué)信號傳導(dǎo)能力上同HSFB相近。

機械牽張力可誘導(dǎo)NSFB轉(zhuǎn)化為HSFB[15]。與NSFB相比，HSFB合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力較高，突出表現(xiàn)在TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA等重要分子標(biāo)志物的表達水平較高[16]。TGF-β1是NSFB向HSFB轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵刺激因子，可協(xié)同機械牽張力的刺激作用促使細(xì)胞表達α-SMA，以增強成纖維細(xì)胞收縮力；TGF-β1可刺激細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原的分泌，同時抑制其降解[17]，以促進組織愈合，刺激纖維增生。此外，HSFB具有優(yōu)于NSFB的細(xì)胞增殖能力。本研究結(jié)果顯示，在加載0.1Hz、10%拉伸幅度的機械牽張力5d時，NSFB內(nèi)TGF-β1、Ⅰ型膠原、α-SMA的表達水平及細(xì)胞增殖能力與未加載機械張力的HSFB極為相近，這證實當(dāng)加載機械牽張力5d時NSFB具有同HSFB相近的生化反應(yīng)及細(xì)胞增殖能力。

綜上所述，加載0.1Hz、10%拉伸幅度的機械牽張力作用5d時，NSFB表現(xiàn)出HSFB的典型特征，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的最佳加載時間為5d，可作為標(biāo)準(zhǔn)力學(xué)模型參數(shù)進一步研究增生性瘢痕形成機制及治療方法。此外，在加載機械牽張力7d時，NSFB的各分子表達水平已超出未加載機械牽張力的HSFB，雖然不可否認(rèn)此時的NSFB未停止向HSFB轉(zhuǎn)化，但已超出正常HSFB的標(biāo)準(zhǔn)表征，可能會發(fā)生過度轉(zhuǎn)化，仍需進一步實驗研究過度加載機械牽張力會對成纖維細(xì)胞產(chǎn)生何種功能上的影響甚至表型的影響。

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[收稿日期]2018-01-29 [修回日期]2018-05-15

編輯/朱婉蓉