孫曉濤 田惠 李軍霞 羅靜 張曉英 郭建瑞 高崇 李小峰

[摘要] 目的 探討甲基強的松龍（Methylprednisolone，MP）治療對強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis，AS）患者外周血單核細胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）IL-23、IL-17基因表達及Th17、Treg細胞分布狀態(tài)的影響及意義。 方法 選取30例活動期AS患者為實驗組，予短期大劑量MP治療，治療方案為2.5～4 mg/kg，Qd，每個療程3～4 d，間隔3～4 d，2～3個療程；選取30例正常人作為對照組，予等體積生理鹽水，給藥時間、方式同前。RT-PCR檢測對照組及MP治療實驗組前后PBMCs IL-23 P19 mRNA、IL-17A mRNA表達水平，F(xiàn)CM檢測PBMCs Th17、Treg細胞分布狀態(tài)，分析其與臨床癥狀、疾病活動性指標的相關(guān)性。 結(jié)果 1.實驗組Th17細胞分布及IL-23、IL-17基因表達治療高于對照組，與BASDAI、夜間痛、血沉、CRP指標之間呈正相關(guān)；實驗組Treg細胞分布低于對照組，與上述指標呈負相關(guān)。2.實驗組Th17細胞分布、IL-23基因表達及IL-17基因表達之間互呈正相關(guān)，IL-23基因表達和Treg細胞分布呈負相關(guān)，Th17細胞分布和Treg細胞分布呈負相關(guān)；3.實驗組經(jīng)MP治療后BASDAI、BASFI、夜間痛、血沉、CRP較治療前均下降，IL-23、IL-17基因表達及Th17細胞分布較治療前均下降，Treg細胞分布較治療前上升；以上差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 IL-23/IL-17軸、Th17/Treg細胞失衡可能參與AS的發(fā)病及病情活動，而MP可通過抑制促炎因子IL-23、IL-17分泌、糾正Th17/Treg失衡改善AS臨床癥狀并降低疾病活動度。

[關(guān)鍵詞] 強直性脊柱炎；甲基強的松龍；IL-17；IL-23；Th17；Treg

[中圖分類號] R593.23 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）15-0029-05

Influence of methylprednisolone on IL-23/IL-17 and Th17/Treg of peripheral blood in patients with ankylosing spondylitis

SUN Xiaotao TIAN Hui LI Junxia LUO Jing ZHANG Xiaoying GUO Jianrui GAO Chong LI Xiaofeng

Department of Rheumatology， Second Hospital of Shanxi Medical University， Taiyuan 030000， China

[Abstract] Objective To investigate the influence and significance of methylprednisolone（MP） on the genetic expression and distribution of peripheral blood mononuclear cells（PBMCs） IL-23 and IL-17 as well as Th17 and Treg in patients with ankylosing spondylitis（AS）. Methods 30 patients in the active period of AS were selected as study group and treated with short-term and high-dose MP. The treatment regimen was 2.5-4 mg/kg， Qd， 3-4 d/course， 3-4 d interval and 2-3 courses. 30 healthy persons were selected as control group and given isometric normal saline by the same administration time and method.RT-PCR test was used to assess the expression of PBMCs IL-23 P19 mRNA and IL-17A mRNA， and FCM was used to assess the cell distributions of PBMCs Th17 and Treg in control group and study group before and after treatment. Associations of them with clinical symptoms and indicators of disease activity were analyzed. Results 1.Cell distribution of Th17 and genetic expression of IL-23 and IL-17 in study group were higher than those in control group， and positively associated with BASDAI， hypnalgia， erythrocyte sedimentation rate（ESR） and CRP.Cell distribution of Treg in study group was lower than that in control group， and negatively associated with indicators mentioned above. 2.In study group， cell distribution of Th17， genetic expression of IL-23 and genetic expression of IL-17 were positively associated with each other， and the genetic expression of IL-23 and the cell distribution of Th17 were negatively associated with the cell distribution of Treg respectively. 3.In study group， BASDAI， BASFI，hypnalgia，ESR and CRP after treatment were lower than those before treatment while cell distribution of Treg after treatment was higher than that before treatment. All the differences above were statistically significant.Conclusion The axis of IL-23/IL-17 and the unbalance of Th17/Treg could be involved in the attack and disease activity of AS.MP could improve the clinical symptoms of AS and reduce the disease activity by inhibiting the secretion of proinflammatory factors IL-23 and IL-17， and correcting the unbalance of Th17/Treg.

[Key words] Ankylosing spondylitis； Methylprednisolone； IL-17； IL-23； Th17； Treg

強直性脊柱炎是一種常見的炎性風濕系統(tǒng)疾病，主要累及中軸關(guān)節(jié)如脊柱和骶髂關(guān)節(jié)，可引起典型炎性腰背痛，導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能障礙使患者的生活質(zhì)量嚴重下降。但是與風濕系統(tǒng)其他疾病如類風濕關(guān)節(jié)炎不同，用于治療強直性脊柱炎的藥物較少，根據(jù)ASAS/EULAR關(guān)于強直性脊柱炎的管理建議，通常僅予非甾體抗炎藥物（Non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAID）緩解疼痛，療效欠佳時加用腫瘤壞死因子α拮抗劑（Anti-TNFα），而針對強直性脊柱炎的外周表現(xiàn)，在上述用藥基礎(chǔ)上同時予緩解病情的抗風濕性藥物（disease modifying anti-rheumatic drug，DMARD）及糖皮質(zhì)激素[1]。至今為止，研究發(fā)現(xiàn)有30%～40%的患者接受上述治療方案后仍處于疾病活動期[2-3]，因此，尋找新的治療策略成為當前治療AS急需解決的問題。目前，在自身免疫性疾病方面，Th17細胞和Treg細胞之間的平衡為發(fā)病機制作出新的解釋[4]，且大劑量糖皮質(zhì)激素對于治療活動性AS患者的有效性已經(jīng)得到證實[5]。本實驗旨在探討MP治療對與活動性AS患者PBMCs IL-23、IL-17基因表達水平及Th17細胞、Treg細胞分布狀態(tài)的影響及意義，嘗試為MP用于今后AS的治療尋找理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

納入標準：符合Vander Linden等在家族和人群調(diào)查的基礎(chǔ)上于1984年提出修改的紐約標準（MNY標準）[6]，年齡18～60歲，強直性脊柱炎疾病活動指數(shù)（Bath Ankylosing Spondylitis Disease Activity In-ex，BASDAI）≥4 分[7]。排除標準[8]：除外有心肌梗死病史、腦梗死病史、不受控制的動脈高血壓病史、糖尿病病史、腎臟病史或肝臟病史、明確糜爛或胃腸道潰瘍性病史、出血史、支氣管哮喘病史或其他慢性疾病加重期，病毒性肝炎，艾滋病毒感染，腫瘤或血液系統(tǒng)疾病、孕婦。30例實驗組患者均于2014年8月～2015年1月就診于我科明確診斷為AS，其中男21例，女9例，年齡18～54歲，平均（35±12）歲。對照組為相匹配30例正常人，男18例，女12例，年齡23～56歲，平均（32±10）歲。參與該實驗的每位受試者均簽署激素使用知情同意書，且本研究已取得倫理委員會批準，嚴格按照臨床試驗規(guī)范進行。

1.2 方法

1.2.1 干預(yù)措施 實驗組予短期大劑量注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉注射液（規(guī)格40 mg，Pfizer Manufacturing Belgium NV，國藥準字H20130301）靜脈滴注治療，方案2.5～4 mg/kg，1次/d，每個療程3～4 d，間隔3～4 d，2～3個療程，同時予胃黏膜保護劑。對照組予等體積生理鹽水，給藥時間、方式同前。

1.2.2 填寫AS病例調(diào)查表以及BASDAI、BASFI表格 所有AS患者均在醫(yī)生指導(dǎo)下填寫AS病例調(diào)查表及BASDAI、BASFI表格，采用BASDAI、脊柱痛VAS評估患者的臨床癥狀及體征，采用BASFI、夜間痛VAS評估患者軀體功能，采用枕墻距、指地距、胸廓活動度、Schober試驗評估患者骨骼及肌肉活動度，監(jiān)測ESR、CRP、肝腎功。

1.2.3 測定PBMCs IL-17、IL-23基因表達水平、Th17、Treg細胞分布狀態(tài)

1.2.3.1 分離PBMCs 安靜狀態(tài)下取靜脈血8 mL，分別置于2支肝素鋰抗凝管中，采用Ficoll密度梯度分離法分離PBMCs。

1.2.3.2 熒光定量PCR（real-time PCR）測定IL-23、IL-17基因表達 ①總RNA抽提與定量：收集提純后的PBMCs 1×106個/mL，按試劑盒說明書（TaKaRa）步驟抽提總RNA，紫外分光光度計測定RNA含量。②反轉(zhuǎn)錄-PCR：按試劑盒說明，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。③擴增引物設(shè)計：以 GAPDH作為內(nèi)參基因，檢索NCBI數(shù)據(jù)庫獲得目的基因IL-23p19、IL-17A的全長序列，Oligo6設(shè)計相應(yīng)引物，引物均由上海生工生物有限公司合成。見表1。④RT-PCR：采用SYBRR Premix EX TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa），使用PRISM 7300型熒光定量PCR儀器（ABI，美國）檢測，CT值是PCR儀檢測到反應(yīng)體系中熒光信號的強度值，ΔCT實驗組=（CT，目的基因-CT，管家基因）實驗組，ΔCT對照組=（CT，目的基因-CT，管家基因）對照組，ΔΔCT=ΔCT實驗組-ΔCT對照組，2-ΔΔCt即為兩組的差異。

1.2.3.3流式細胞術(shù)測定Th17細胞 ①細胞培養(yǎng)：收集提純后的PBMCs，以每孔1×106個/mL細胞種于48孔板中，加入PMA（2 μL），Iono（10 μL）刺激，放入37℃無菌細胞培養(yǎng)箱中，1 h后向細胞懸液中加1 μL高爾基阻斷劑，孵育4～6 h后收集細胞。②細胞標記：以CD4-FITC設(shè)門，固定，破膜，應(yīng)用IL-17A PE（5 μL）標記Th17細胞。③流式細胞儀檢測：采用FACSCalibur流式細胞儀（Becton Dickinson公司，美國）檢測Th17細胞百分率，以Cell Quest軟件獲取、分析實驗結(jié)果。

1.2.3.4 流式細胞術(shù)測定Treg細胞 ①細胞標記：以CD4-FITC設(shè)門，固定，破膜，用CD25 APC（5 μL）、FOXP3 PE（5 μL）標記Treg細胞。②流式細胞儀檢測：所用流式細胞儀及分析軟件同Th17。具體操作參照試劑說明書步驟。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）進行統(tǒng)計描述，計數(shù)資料以率描述，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布者組間比較采用t檢驗，否則采用秩和檢驗。相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗組治療前與對照組及實驗組接受MP治療前后IL-17、IL-23基因表達水平及Th17、Treg細胞分布狀態(tài)比較

實驗組治療前與對照組相比，IL-17、IL-23基因表達及Th17細胞分布明顯升高，Treg細胞分布明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；實驗組接受MP治療后與治療前相比IL-23基因表達、IL-17基因表達、Th17細胞分布較治療前下降，Treg細胞分布較治療前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見封三圖3～6、表2。

2.2 實驗組IL-17、IL-23基因表達水平及Th17、Treg細胞分布與各臨床指標的相關(guān)性分析

實驗組IL-17基因表達與所評估指標呈正相關(guān)，IL-23基因表達除與BASFI評分無顯著相關(guān)性外，與其余指標呈正相關(guān)；實驗組Th17細胞分布與所評估指標呈正相關(guān)，實驗組Treg細胞分布除與BASFI評分無顯著相關(guān)性外，與其余指標呈負相關(guān)。見表3。

2.3 實驗組PBMCs IL-23、IL-17基因表達水平與Th17、Treg分布狀態(tài)的相關(guān)性分析

實驗組IL-23基因表達、IL-17基因表達、Th17細胞分布之間互呈正相關(guān)，IL-23基因表達、Th17細胞分布與Treg細胞分布呈負相關(guān)，而IL-17基因表達與Treg細胞分布之間無明顯相關(guān)性。見表4。

2.4 實驗組MP治療前后臨床指標變化

MP治療前后對實驗組所有患者脊柱痛、夜間痛、BASDAI評分、BASFI評分、胸廓活動度、枕墻距、指地距、Schober試驗進行評估記錄，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)接受治療后以上指標均有所改善（P<0.05）。見表5。

2.5不良反應(yīng)

經(jīng)MP治療后實驗組患者出現(xiàn)2例血壓升高，1例輕度肝功能異常，2例上呼吸道感染，2例血糖升高，3例睡眠障礙。經(jīng)對癥處理后，所有癥狀均好轉(zhuǎn)。給藥前后動態(tài)監(jiān)測血、尿常規(guī)及腎功能，均未見明顯異常，無嚴重不良事件發(fā)生。1年后對患者進行電話隨訪，結(jié)果如下：2例患者失訪，2例患者癥狀反復(fù)，余患者均規(guī)律復(fù)診，無炎性下腰痛、足跟痛等AS相關(guān)臨床癥狀，復(fù)查血常規(guī)、血沉、肝腎功能均未見明顯異常，無骨質(zhì)疏松、心血管疾病及嚴重不良事件發(fā)生。

3 討論

針對實驗組疾病復(fù)發(fā)的問題，臨床上仍采用免疫抑制劑、生物制劑及非甾體藥物的治療方案，院外建議患者長期鍛煉、定期復(fù)診，同時在隨診階段，根據(jù)患者病情調(diào)整口服藥物劑量。分析2例患者臨床癥狀反復(fù)發(fā)作的原因，可能與其自行停服藥物相關(guān)。關(guān)于AS患者遠期療效及MP治療的副作用仍需長期隨訪觀察。

AS是脊柱關(guān)節(jié)?。⊿PA）中最常見的亞型，是一種主要累及中軸關(guān)節(jié)的慢性炎癥性疾病。既往隊列研究顯示，國內(nèi)AS患病率為0.3%，發(fā)病年齡為（29.2±11.4）歲，男女比例為2.7：1[9]。該病以炎性腰背痛、不對稱的外周關(guān)節(jié)炎和附著點炎為主要特征。最常見的關(guān)節(jié)外表現(xiàn)是葡萄膜炎、牛皮癬、炎癥性腸病。該病可導(dǎo)致腰背及四肢多關(guān)節(jié)疼痛、僵硬以及終末期的關(guān)節(jié)融合，致殘率極高，給患者、家庭及社會帶來了沉重的精神和經(jīng)濟負擔[10，11]。

既往大部分學(xué)者認為Th1和Th2在自身免疫性疾病中具有不可替代的炎癥效應(yīng)，然而，自1995年發(fā)現(xiàn)IL-17以來，越來越多的焦點關(guān)注在IL-17/IL-23軸和Th17和Treg細胞的平衡[4]。Th17細胞是一類可以分泌多種特異性細胞因子（如IL-17、IL-17F、IL-21和IL-22）的T細胞亞型，上述細胞因子均參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。研究證明，在類風濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、銀屑病和炎性腸病等各種自身免疫性疾病的發(fā)病機制中，IL-17均起到關(guān)鍵作用[12-13]。

IL-17不僅可以與IL-6和IL-1協(xié)同促進Th17細胞的分化，且能促進Th17細胞分泌炎性細胞因子[14]。Treg細胞也是T細胞的亞型之一，以高表達IL-2受體α鏈（CD25）和Foxp3轉(zhuǎn)錄因子為特征。目前對Treg細胞的作用尚不明確，但越來越多的證據(jù)表明Foxp3 + Treg細胞可以通過直接或間接的途徑抑制免疫應(yīng)答[15]。Th17細胞與Treg細胞之間存在相關(guān)性，如TGF-β的刺激可同時誘導(dǎo)兩者的分化，但與IL-6或IL-21結(jié)合后，則起到抑制Treg細胞的效果[16]。分子水平上，F(xiàn)oxp3與RORγt和RORα物理結(jié)合相互拮抗可能是Th17細胞與Treg細胞之間相互作用的基礎(chǔ)[17]。此外，HIF1α可以結(jié)合并增強RORγt的表達促進Th17細胞的分化，同時又可以通過抑制Foxp3的表達進而減少Treg細胞的分化[18]。生理情況下，兩種T細胞亞型之間的平衡維持了免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，但兩者關(guān)系的破壞會導(dǎo)致一系列自身免疫性疾病[19]。Th17細胞是高表達IL-17的CD4+T細胞亞群之一，IL-23可以刺激其擴增并維持其活性，在抗原刺激的作用下，IL-23表達增加，進而促進Th17細胞分化，誘發(fā)自身免疫性疾病[20]。Th17分化受Th1、Th2調(diào)控，在AS中存在Th1、Th2平衡偏移狀況。Treg細胞是具有免疫耐受作用的CD4+T細胞，可通過下調(diào)IL-23、IL-17表達水平或通過其特異轉(zhuǎn)錄因子Foxp3來抑制Th17細胞分化[21]，其數(shù)量及功能異?？蓪?dǎo)致自身免疫性疾病發(fā)生[22]。不可否認，越來越多的證據(jù)表明IL-17/IL-23軸，Th17和Treg細胞的平衡參與了強直性脊柱炎的發(fā)病[23]。

本研究顯示，AS PBMCs IL-23、IL-17基因的表達、Th17細胞分化較正常人升高，而Treg細胞活性低于正常人，與之前的研究結(jié)果一致[24]，說明其在AS的發(fā)病機制中起了重要的作用。AS尚無明確的疾病緩解標準，缺乏有效治療方案，目前常用的有非甾體類抗炎藥、柳氮磺吡啶腸溶片、糖皮質(zhì)激素（Glucocorticoid GC）、生物制劑等。在20世紀80年代后期，低劑量的糖皮質(zhì)激素首次用于非甾體類抗炎藥物治療效果不佳的患者。迄今為止，糖皮質(zhì)激素對自身免疫性疾病的治療效果已經(jīng)被大量研究所證實[25]，但由于其副作用和長期使用存在的藥物毒性，多數(shù)患者仍然拒絕激素的治療方案。Rumiantseva等[26]給予患者短期大劑量糖皮質(zhì)激素治療，均可以觀察到迅速的疾病緩解，41%的患者可以持續(xù)3個月，其中9%的患者臨床指標具有統(tǒng)計學(xué)意義，因此得出短期大劑量糖皮質(zhì)激素對于多數(shù)活動性AS患者療效顯著且具有良好的耐受性的結(jié)論，與Richter等[27]的結(jié)論一致，其認為MP不僅具有迅速緩解炎癥的作用，還有持續(xù)的免疫效應(yīng)。Haibel等[5]在AS患者口服強的松治療的隨機雙盲對照臨床研究中，結(jié)果顯示高劑量組（50 mg/d）及低劑量組（20 mg/d）BASDAI評分較安慰劑組均有所改善，且高劑量組（50 mg/d）改善程度優(yōu)于低劑量組。

甲基強的松龍是糖皮質(zhì)激素的一種，因其起效快、作用持久且副作用偏小，被廣泛應(yīng)用于治療大多數(shù)炎性風濕系統(tǒng)疾病上，療效顯著[28]。且目前已有研究表明，大劑量的MP靜脈注射可以通過增加活動期SLE患者Treg細胞的數(shù)量來阻止疾病的進展[29]。近10年，對AS治療的相關(guān)基礎(chǔ)研究表明：MP對于AS患者療效確切，可明顯改善AS患者臨床癥狀、體征、炎性指標，靜脈大劑量治療時臨床指標改善程度明顯優(yōu)于小劑量口服激素，且安全性較好，在難治性AS患者尤為明顯。我們前期研究同時證明MP可通過抑制促炎因子 IFN-γ、TNF-α等的分泌，調(diào)節(jié)Thl、Th2細胞失衡狀態(tài)從而發(fā)揮療效，并能顯著緩解AS的眼部受累癥狀，與既往研究結(jié)論一致[30]。

綜上，在AS發(fā)病機制中，IL-23、IL-17基因表達的改變、Th17/Treg失衡可能參與其發(fā)病，MP可通過抑制IL-17、IL-23基因表達，改變Th17細胞、Treg細胞數(shù)量進而影響Th17/Treg平衡，可能是MP治療AS相關(guān)機制之一，為AS治療提供了新思路。

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（收稿日期：2018-01-16）