鐘倫坤 周興瑋 何嫻 朱佳麗 黃秀麗 何騰 孫永東

西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院（四川瀘州646000）

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM），中醫(yī)上稱作耳脹、耳閉，是一種由多種病因?qū)е碌闹卸腔撔约膊?，主要臨床特征為中耳積液、聽力下降，并可引發(fā)多種嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括中耳粘連、聽骨壞死等。國(guó)內(nèi)外研究［1]發(fā)現(xiàn)，2～7歲發(fā)病率最高，約為7.3%～30.7%，2歲左右為高峰，且隨年齡增長(zhǎng)而下降。該病治療方法眾多，臨床效果和優(yōu)缺點(diǎn)各不相同，但目前尚無(wú)統(tǒng)一規(guī)范的治療藥物。局部切開置管等手術(shù)方法有創(chuàng)和治療費(fèi)用高［2-3]，而且可能引發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前中醫(yī)界正在尋找療效確切并且對(duì)全身及局部均有效的中成藥來(lái)治療分泌性中耳炎。

清竅膠囊是我院科室獨(dú)創(chuàng)治療分泌性中耳炎的經(jīng)驗(yàn)協(xié)定方藥，經(jīng)20多年的臨床觀察，效果肯定，成為院內(nèi)制劑醫(yī)保甲類，經(jīng)10多年的潛心研究，發(fā)現(xiàn)其能調(diào)節(jié)機(jī)體自身，改善機(jī)體免疫功能和中耳粘膜的排泄清理功能，并且可提高聽力作用（改善耳蝸微循環(huán)），對(duì)多種病因的分泌性中耳炎療效確切。本研究旨在通過(guò)對(duì)清竅膠囊治療分泌性中耳炎的療效以及動(dòng)物抗炎癥試驗(yàn)進(jìn)行更深入的研究，進(jìn)一步評(píng)價(jià)清竅膠囊治療分泌性中耳炎的有效性，并了解其抗炎的分子機(jī)制，為“清竅膠囊”的新藥開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料前瞻性納入我院2014年12月至2015年11月收治的80例分泌性中耳炎患者為研究對(duì)象，隨機(jī)分為對(duì)照組和治療組，每組40例，對(duì)照組中男23例，女17例，年齡范圍4～65歲，平均（29.6±5.6）歲；治療組中男21例，女19例，年齡范圍5～67歲，平均年齡為（30.0±5.9）歲，兩組患者在年齡、性別、基礎(chǔ)疾病等的分布上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)（1）耳痛、耳悶、耳鳴和聽力下降；（2）鼓膜內(nèi)陷、活動(dòng)受限和積液征；（3）純音測(cè)聽：傳導(dǎo)性聾；（4）聲導(dǎo)抗：鼓室壓圖有平坦型（B型）的典型特征；高負(fù)壓型（C型）示咽鼓管功能不良，部分有鼓室積液、鐙骨肌反射消失；（5）鼓膜穿刺抽出積液（對(duì)于C型中不能抽出鼓室積液的不納入本研究中）。

1.3 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合以上診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡2～70歲；（3）無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥如鼓室嚴(yán)重粘連及硬化；（4）無(wú)其他嚴(yán)重的全身疾病者；（5）急性分泌性中耳炎（病程3個(gè)月內(nèi)）；（6）簽署研究知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠期及哺乳期婦女、精神疾病病人；（2）＜2歲或＞70歲患者；（3）有頭孢類藥物過(guò)敏史者；（4）因腭扁桃體肥大、腺樣體肥大、腭裂、鼻竇炎、鼻咽纖維血管瘤及鼻咽癌等原因引起的分泌性中耳炎；（5）慢性分泌性中耳炎。剔除標(biāo)準(zhǔn)：（1）無(wú)完整病歷資料且無(wú)法判斷療效；（2）中途退出觀察，不能判斷療效者；（3）研究病例結(jié)束后無(wú)法隨者。

1.4 分組方法組1：頭孢克洛膠囊（昆明積大制藥有限公司，批號(hào)040103），成人0.5 g/d，每日3次，兒童20 mg/（kg·d），一個(gè)療程為10 d。組2：清竅膠囊，成人1.6 g/次，每日3次，兒童按照120 mg/（kg·d）溫?zé)崴谭?，每?次。共2個(gè)療程，1個(gè)療程為期10 d。共觀察1～2個(gè)療程，觀察期間，兩組均不得使用其它任何藥物（“列入標(biāo)準(zhǔn)”允許的藥除外）。

表1 兩組一般資料比較Tab.1 Characteristics of the patients in the two groups

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只昆明大鼠購(gòu)自瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級(jí)，重量18～25 g，耳廓反射靈敏。將其隨機(jī)分成3組，分別為對(duì)照組、安慰劑組和治療組，每組20只，所有小鼠都通過(guò)了耳窺鏡的檢查，結(jié)果表明所有小鼠均無(wú)外耳道和中耳感染。

1.6 建模方法將1.2 mg卵清蛋白溶于0.6 mL PBS緩沖液配置成溶液，同時(shí)使用5.14 mg的氫氧化鋁作為免疫佐劑，腹腔注射對(duì)照組和清竅膠囊治療組的小鼠，每周1次共2周，此過(guò)程為全身致敏階段，2周后，用20%烏拉坦以5 mL/kg的劑量腹腔內(nèi)注射麻醉小鼠，將15μL配置的OVA/PBS混合液經(jīng)鼓膜前下方注入鼓室，24 h后再次麻醉小鼠，觀察鼓膜狀態(tài)，注射第2次，此為耳內(nèi)激發(fā)階段，建立分泌性中耳炎小鼠模型，造模成功標(biāo)志參照Pollock HW等的小鼠造模實(shí)驗(yàn)［5]。

1.7 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器卵清蛋白（Ovalbumin）為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，小鼠、人HIF-1a、VEGF的ELISA試劑盒均為默克公司產(chǎn)品。清竅膠囊為醫(yī)院內(nèi)制劑，批準(zhǔn)文號(hào)：川藥制字Z20080310。配方如下：玄參9 g、生地9 g、丹參12 g、川牛膝6 g、僵蠶4 g、當(dāng)歸9 g、薏苡仁18 g、豆蔻6 g、甘草9 g。酶標(biāo)儀為美國(guó)Promega公司生產(chǎn)。

1.8 療效評(píng)價(jià)比較兩組電測(cè)聽、聲阻抗和不良反應(yīng)發(fā)生率。其中電測(cè)聽［6]分別在 500、1 000、2 000 Hz頻率下取平均聽閥，聽力≤26 dB為正常；＞26 dB輕度耳聾；＞41 dB中度耳聾；＞56 dB重度耳聾；＞71 dB是聽力幾乎損失。運(yùn)用GSl2000 TympstarII型中耳分析儀，226 Hz探測(cè)音，分別測(cè)試雙耳的外耳道容積、聲順值、峰壓值，并繪制鼓室導(dǎo)抗圖［7]。不良反應(yīng)［8]：主要為心慌、過(guò)敏、白細(xì)胞減少、惡心嘔吐等。分別于治療前后用ELISA法檢測(cè)兩組患者中耳積液中HIF-1a、VEGF的水平變化。

1.9 分泌性中耳炎模型小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的表達(dá)水平將60只小鼠按照1.5中的方法造模成功后，隨機(jī)分為3組，每組20只，分別為安慰劑組、對(duì)照組對(duì)和治療組，采用ELISA法檢測(cè)3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的濃度。

1.10 清竅膠囊對(duì)小鼠HIF-VEGF通路信號(hào)分子的影響將清竅膠囊內(nèi)容物配成濃度為0.4 g/mL的溶液，按0.2 mL/10 g體質(zhì)量灌胃，上、下午各1次。7天為1個(gè)療程，連續(xù)使用2個(gè)療程，對(duì)照組按頭孢克洛膠囊內(nèi)容物配成濃度為0.4 g/mL的溶液，按照0.2 mL/10 g體質(zhì)量灌胃，安慰劑組同法給予等體積生理鹽水灌胃。ELISA法檢測(cè)3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的濃度。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié) 果

2.1 清竅膠囊對(duì)分泌性中耳炎的臨床療效觀察

2.1.1 兩組電測(cè)聽和聲阻抗測(cè)試治療前兩組電測(cè)聽差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；經(jīng)治療后，組2電測(cè)聽高于組1（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。組1和組2各80耳中，B型分別為59耳、57耳，C型分別為為21耳、23耳（負(fù)壓水平超過(guò)一200 daPa），治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，組1的80耳中，14耳為As型，5耳為A型，47耳為B型，14耳為C型，組2的80耳中，32耳為As型，4耳為A型，27耳為B型，7耳為C型，兩組耳型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.1.2 兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較組2和組1總的不良反應(yīng)發(fā)生率分別為7.50%和20.00%，組2明顯低于組1，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.2 建模前后3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的表達(dá)水平的比較與建模前相比，3組在建模后中耳積液中HIF-1a、VEGF的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表5），且3組治療前中耳積液中HIF-1a、VEGF差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩組電測(cè)聽的對(duì)比Tab.2 Comparison of electro-audiometer in the two groups before and after the treament

表4 兩組不良反應(yīng)發(fā)生率比較Tab.4 Comparison of adverse effect in the two groups after the treament 例（%）

表5 分泌性中耳炎模型小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的改變Tab.5 Comparison of level of HIF-1a and VEGFin the three groups before and after the modeling ±s

表5 分泌性中耳炎模型小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF的改變Tab.5 Comparison of level of HIF-1a and VEGFin the three groups before and after the modeling ±s

注：a與造模前相比，P＜0.05

分組安慰劑組對(duì)照組治療組例數(shù)20 20 20 HIF-1a（ng/mL）造模前0.51±0.11 0.50±0.12 0.52±0.13造模后6.71±1.11a 6.86±1.30a 6.76±1.18a VEFG（ng/mL）造模前0.42±0.19 0.43±0.18 0.41±0.20造模后5.82±1.19a 5.68±1.12a 5.95±1.48a

2.3 治療前后3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF水平比較如表6所示，3組治療前中耳積液中HIF-1a、VEGF濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后均顯著下降（P＜0.05），且安慰劑組、對(duì)照組和治療組上述兩種因子濃度依次降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表6 治療前后3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF水平比較Tab.6 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the three groups before and after the treament ±s

表6 治療前后3組小鼠中耳積液中HIF-1a、VEGF水平比較Tab.6 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the three groups before and after the treament ±s

注：a與治療前比較，P ＜ 0.05；b與安慰劑組比較，P ＜ 0.05；c與對(duì)照組比較，P＜0.05

分組安慰劑組對(duì)照組治療組F值P值例數(shù)20 20 20 HIF-1a（ng/mL）治療前5.78±1.20 5.86±1.30 5.76±1.18 88.26 0.0014治療后4.68±0.28a 3.16±0.25ab 1.26±0.23abc 41.21 0.017 VEGF（ng/mL）治療前5.44±1.22 5.42±1.21 5.53±1.28 65.17 0.0006治療后4.32±0.24a 3.21±0.26ab 1.67±0.18abc#28.16 0.019

2.4 清竅膠囊對(duì)分泌性患者中耳積液中HIFVEGF通路信號(hào)分子的影響如表7所示，治療后，2組中耳積液HIF-1a、VEGF濃度均顯著低于治療前，且組2中耳積液中HIF-1a、VEGF的濃度明顯低于組1（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表7 兩組治療前后中耳積液中HIF-1a、VEGF分泌量比較Tab.7 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the two groups before and after the treament ±s

表7 兩組治療前后中耳積液中HIF-1a、VEGF分泌量比較Tab.7 Comparison of level of HIF-1a and VEGF in the two groups before and after the treament ±s

注：a與治療前比較，P ＜ 0.05；b與組2比較，P ＜ 0.05

分組組1組2 t值P值例數(shù)40 40 HIF-1a(ng/mL)治療前6.63±1.17 6.75±1.38 0.68 0.092治療后3.47±1.04ab 2.28±1.12a 8.16 0.025＊VEGF(ng/mL)治療前6.15±1.27 6.21±1.43 0.27 0.121治療后4.26±1.38ab 2.56±1.03a 10.26 0.021＊

3 討論

分泌性中耳炎（secretory otitis media，SOM）是臨床上的常見(jiàn)感染性耳部疾病，西醫(yī)上總結(jié)其病因包括咽鼓管功能障礙、感染、免疫反應(yīng)等方面。分泌性中耳炎可誘發(fā)多種后遺癥，如中耳粘連、鼓膜萎縮硬化、等，影響患者的身心健康。臨床上有多種治療手段，如內(nèi)科治療包含全身藥物治療（中藥、抗生素，抗過(guò)敏藥物）、局部藥物治療；外科治療有鼓膜穿刺抽液、鼓膜切開術(shù)等多種手術(shù)方法。各種方式針對(duì)性強(qiáng)，各有優(yōu)缺點(diǎn)，有一定療效，但多不理想。目前的各種手術(shù)方法因其具有損傷性及痛苦性，無(wú)法作為分泌性中耳炎的首選治療方法［2，10]。中醫(yī)觀點(diǎn)以為正氣不足，內(nèi)蘊(yùn)濕熱，外受風(fēng)邪，致熱毒墮盛，循肝膽經(jīng)上沖于耳竅是引起耳張、耳閉的主要原因。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，IL家族（如IL-1B、IL-2、IL-4等）以及TNF-α、VEGF和HIF-1a等與中耳炎密切相關(guān)［11]。同時(shí)，較多的學(xué)者認(rèn)為HIF-VEGF信號(hào)通路可能為中耳炎發(fā)病的重要機(jī)制，如SEMENZA等［11]發(fā)現(xiàn)在分泌性中耳炎大鼠模型中耳黏膜HIF-1a、VEGF的基因和蛋白的表達(dá)水平明顯升高；重組VEGF蛋白注入鼠的中耳腔用來(lái)建立分泌性中耳炎動(dòng)物模型［12]，HIF-VEGF信號(hào)通路在血管增生、通透性增加的過(guò)程中扮演重要角色，同時(shí)文獻(xiàn)證據(jù)顯示其在SOM中耳積液產(chǎn)生方面可能也具有重要作用［13]。但國(guó)內(nèi)鮮有相關(guān)報(bào)道鮮有。本研究通過(guò)建立分泌性中耳炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)HIF-VEGF在分泌性中耳炎小鼠模型中的表達(dá)明顯升高，與文獻(xiàn)中相符，促使我們更深入的了解分泌性中耳炎模病理及生理機(jī)制。

進(jìn)一步探討清竅膠囊對(duì)急性分泌性中耳炎患者的影響，結(jié)果表明，清竅膠囊在動(dòng)物水平和人體水平上均可抑制HIF-VEGF信號(hào)通路，治療后HIF-1a、VEGF濃度均顯著下降。此外，與常規(guī)治療藥物頭孢克洛相比，清竅膠囊的臨床療效更優(yōu)，患者聽力顯著提升，同時(shí)不良反應(yīng)發(fā)生率顯著較低。這可能主要是因?yàn)椋呵甯[膠囊是根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)配制而成，可做到標(biāo)本兼治，延緩中耳分泌液的產(chǎn)生，促進(jìn)吸收，促使阻塞的咽鼓管逐漸通暢。其發(fā)揮藥理作用的特點(diǎn)包括［14]：（1）可明顯提高機(jī)體的免疫功能，并促進(jìn)中耳黏膜排泄和清理；（2）通過(guò)改善耳蝸微循環(huán)以提高聽力。

雖然本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)治療后各組HIF-1a、VEGF濃度未恢復(fù)到治療或造模前水平，但已經(jīng)非常接近。另外，由于本研究周期只有2個(gè)療程，相對(duì)較短，考慮到中藥起效時(shí)間比較緩慢，所以需要今后進(jìn)行進(jìn)一步開展多中心大樣本研究，并延長(zhǎng)觀察期限進(jìn)行進(jìn)一步探討。另外，清竅膠囊在治療分泌性中耳炎的藥理機(jī)制可能還涉及其他信號(hào)通路，也是未來(lái)研究和探討的方向。

綜上所述，清竅膠囊可能通過(guò)影響HIF-VEGF信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮治療急性分泌性中耳炎的作用，且臨床療效優(yōu)于頭孢克洛膠囊，值得進(jìn)一步臨床推廣。