安曙光 覃炳軍 盧廣軒 范彥琦 賈伯康

廣東省東莞市人民醫(yī)院ICU（廣東東莞 523000）

膿毒癥是一種由于感染所導(dǎo)致的全身性炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），如果不進(jìn)行及時(shí)治療很容易發(fā)展為嚴(yán)重的膿毒癥和多器官功能綜合征［1-2]。2016年，第45屆美國(guó)重癥醫(yī)學(xué)年會(huì)發(fā)布了“膿毒癥-3”新定義及相應(yīng)的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，將膿毒癥定義為針對(duì)感染的宿主反應(yīng)失調(diào)引起的致命性器官功能障礙。有研究人員的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大概有40%的膿毒癥病人最后會(huì)發(fā)展為膿毒癥性急性腎損傷（septic acute renal injury，SIAKI），其病死率能夠達(dá)到70%左右［3-4]。因此進(jìn)行及早的診斷以及及早的科學(xué)干預(yù)是緩解膿毒癥以及預(yù)后的重點(diǎn)。SIAKI的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，具有較大的危害，研究可以早期以及有效可能夠檢測(cè)出患者腎損傷的生物學(xué)標(biāo)志物具有十分重要的臨床價(jià)值［5-6]。根據(jù)最近幾年的研究結(jié)果表明，高遷移率族蛋白Bl（high mobility group box-1 protein，HMCBl）屬于一類十分關(guān)鍵的晚期炎癥介質(zhì)，與膿毒癥的病理生理過程具有直接關(guān)系，可能是一種有效的干預(yù)指標(biāo)之一，但目前對(duì)其與機(jī)體免疫功能之間的聯(lián)系的研究較少［7-8]。本研究深入研究了膿毒血病人血清HMGBl水平的變化與機(jī)體T細(xì)胞免疫功能之間的關(guān)聯(lián)，探索了膿毒血病人免疫功能異常的發(fā)病機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象和分組觀察組選取2015年1月至2017年5月間在我院ICU科的不同程度的80例膿毒癥患者。80例患者中有37例膿毒癥患者，43例嚴(yán)重膿毒癥患者（其中休克患者有11例）。膿毒癥的診斷根據(jù)2001年美國(guó)危重病醫(yī)學(xué)會(huì)、歐洲危重病醫(yī)學(xué)會(huì)、美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)以及美國(guó)胸科學(xué)會(huì)外科感染學(xué)會(huì)聯(lián)席會(huì)議有關(guān)全身性感染定義國(guó)際會(huì)議所制定的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組選擇同期其他病區(qū)（神經(jīng)內(nèi)科、普外科、心內(nèi)科）的住院患者80例，所有受試者都沒有感染等并發(fā)癥出現(xiàn)。按照膿毒癥患者的預(yù)后情況，進(jìn)一步將膿毒癥患者分為死亡組與存活組，其中死亡組23例，采集血標(biāo)本，存活組57例。

1.2 方法

1.2.1 樣品準(zhǔn)備對(duì)所有受試者的血樣進(jìn)行收集，采取含乙二胺四乙酸（EDTA-K2）的無(wú)致熱原試管（美國(guó)BD公司產(chǎn)品）對(duì)靜脈血進(jìn)行收集，每管5 mL，采用2 500 r/min進(jìn)行20 min離心，對(duì)患者的血漿進(jìn)行分離。將血細(xì)胞與同體積的無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行混合，將此血細(xì)胞懸液慢慢放置在無(wú)菌以及無(wú)致熱原的聚蔗糖一泛影葡胺液面上，在18～20℃的條件下進(jìn)行2 500 r/min的20 min離心，對(duì)第二層云霧狀的低密度細(xì)胞進(jìn)行吸取收集，離心洗滌后將紅細(xì)胞進(jìn)行去除。采取單核細(xì)胞以及多形核細(xì)胞能夠粘附塑料以及毛細(xì)玻璃的特點(diǎn)，然后進(jìn)一步將T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分離和純化。

1.2.2 觀察指標(biāo)（1）血清HMGBl水平的檢測(cè)：取患者的血清100μL，采取人HMGBl酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（EUSA）試劑盒（日本Shjno-Test公司）進(jìn)行檢測(cè)，完全根據(jù)說明書進(jìn)行操作，分別計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線以及回歸方程，將樣品吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算出病人的血清HMGBl水平。（2）采取噻唑藍(lán)法對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖活性進(jìn)行檢測(cè)：采取包含體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞濃度調(diào)整到2×106/mL，取0.1 mL細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板進(jìn)行接種，然后添加100μL植物血凝素對(duì)其進(jìn)行刺激。在37℃、5%的CO2孵箱中反應(yīng)68 h，將100μL上清進(jìn)行吸棄，然后再向各孔添加5 mg/mL的MTT 10μL，輕輕混合均勻，在37℃、5%的CO2孵箱中繼續(xù)孵育4 h。然后再添加100μL的曲通異丙醇溶液，在37℃、5%的CO2孵箱中反應(yīng)過夜，測(cè)定波長(zhǎng)為540 nm的吸光度值（A值）。（3）細(xì)胞培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素-2（IL-2）含量測(cè)定：采用人IL-2 ELISA試劑盒（北京晶美生物公司產(chǎn)品）進(jìn)行測(cè)定；（4）流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+/CD8+T細(xì)胞比值：將分離好的外周血單個(gè)核細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液調(diào)整到1×106/mL，吸取100μL懸液放到人流式管內(nèi)，再添加CD8-藻紅蛋白（PE）20μL以及CD4-U藻藍(lán)素（APC）20μL，在避光的條件下混合均勻，反應(yīng)15 min后，再添加400μL磷酸鹽緩沖液。采取流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定（流式細(xì)胞儀和所有熒光標(biāo)記抗體都購(gòu)自美國(guó)BD公司）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件（美國(guó)IBM公司）進(jìn)行處理；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；多組間比較采用單因素方差分析或者重復(fù)測(cè)量的方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示；多組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05代表差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 受試者一般資料三組患者在年齡、性別、體重及身高上的指標(biāo)上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞ 0.05），具有可比性，見表1。

2.2 受試者血清高遷移率族蛋白B1表達(dá)與膿毒癥嚴(yán)重程度的關(guān)系對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞HMGBl表達(dá)量為（5.11±1.30）ng/mL，與對(duì)照組進(jìn)行比較，膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組患者淋巴細(xì)胞基因表達(dá)HMGBl明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組不同程度膿毒癥患者之間，組與組進(jìn)行比較具有明顯差異，見表2。

2.3 受試者T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)變化對(duì)照組T淋巴細(xì)胞增殖的A值為（0.99±0.41），與對(duì)照組進(jìn)行比較，膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組患者T淋巴細(xì)胞增殖明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組不同程度膿毒癥患者之間，組與組進(jìn)行比較具有明顯差異，見表3。

表1 三組患者基本資料情況比較Tab.1 Comparison of basic data in three groups of patients ±s

表1 三組患者基本資料情況比較Tab.1 Comparison of basic data in three groups of patients ±s

分組膿毒癥組嚴(yán)重膿毒癥組對(duì)照組F（χ2）值P值例數(shù)37 43 80--年齡（歲）51.22±8.16 52.35±7.59 52.50±7.14 6.552 0.212性別（男/女，例）21/16 23/20 43/37 3.562 0.351體重（kg）64.51±11.62 66.07±12.88 65.20±14.16 4.521 0.265身高（cm）165.51±6.92 168.31±6.28 166.60±6.35 5.182 0.599

表2 受試者血清HMGBl表達(dá)與膿毒癥嚴(yán)重程度的關(guān)系Tab.2 Relationship between serum HMGBl expression and severity of sepsis in subjects ±s

表2 受試者血清HMGBl表達(dá)與膿毒癥嚴(yán)重程度的關(guān)系Tab.2 Relationship between serum HMGBl expression and severity of sepsis in subjects ±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

分組膿毒癥組嚴(yán)重膿毒癥組對(duì)照組F值P值例數(shù)37 43 80--HMGBl值（ng/mL）23.15±4.21*25.24±4.33*5.11±1.30 12.10 0.001

表3 受試者T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)變化Tab.3 The changes in T lymphocyte proliferation reaction in subjects ±s

表3 受試者T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)變化Tab.3 The changes in T lymphocyte proliferation reaction in subjects ±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

分組膿毒癥組嚴(yán)重膿毒癥組對(duì)照組F值P值例數(shù)37 43 80--T淋巴細(xì)胞增殖（A值）0.41±0.27*0.39±0.23*0.99±0.41 15.96 0.001

2.4 受試者T淋巴細(xì)胞分泌IL-2變化對(duì)照組T淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平為（19.35±5.41）pg/mL，與對(duì)照組進(jìn)行比較，膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組患者T淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組不同程度膿毒癥患者之間，組與組進(jìn)行比較具有明顯差異，見表4。

2.5 受試者CD4+/CD8+T細(xì)胞比值的變化對(duì)照組CD4+/CD8+T細(xì)胞比值為（1.39±0.11），與對(duì)照組進(jìn)行比較，膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組患者T淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平明顯受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組不同程度膿毒癥患者之間，組與組進(jìn)行比較具有明顯差異，見表5。

表4 受試者T淋巴細(xì)胞分泌IL-2變化Tab.4 The changes in IL-2 secretion by Tlymphocytes in subjects ±s

表4 受試者T淋巴細(xì)胞分泌IL-2變化Tab.4 The changes in IL-2 secretion by Tlymphocytes in subjects ±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

分組膿毒癥組嚴(yán)重膿毒癥組對(duì)照組F值P值例數(shù)37 43 80--T淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平（pg/mL）10.03±3.37*8.95±3.31*19.35±5.41 15.02 0.002

表5 受試者CD4+/CD8+T細(xì)胞比值的變化Tab.5 Changes in the ratio of CD4+/CD8+Tcells in the subjects ±s

表5 受試者CD4+/CD8+T細(xì)胞比值的變化Tab.5 Changes in the ratio of CD4+/CD8+Tcells in the subjects ±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05

分組膿毒癥組嚴(yán)重膿毒癥組對(duì)照組F值P值例數(shù)37 43 80--CD4+/CD8+T細(xì)胞比值1.11±0.09*1.02±0.08*1.39±0.11 11.12 0.006

2.6 受試者血清HMGBl基因表達(dá)與受試患者預(yù)后的關(guān)系對(duì)膿毒癥患者死亡組及存活組的血清HMGBl基因表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果表明，死亡組患者淋巴細(xì)胞HMGBl基因表達(dá)明顯高于存活組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 受試者血清HMGBl基因表達(dá)與受試患者預(yù)后的關(guān)系Tab.6 Relationship between serum HMGBl gene expression and prognosis of subjects ±s

表6 受試者血清HMGBl基因表達(dá)與受試患者預(yù)后的關(guān)系Tab.6 Relationship between serum HMGBl gene expression and prognosis of subjects ±s

注：與死亡組比較，*P＜0.05

分組存活組死亡組t值P值37 80--27.51±4.21*40.59±5.47 6.752 0.001例數(shù)HMGBl值（ng/mL）

3 討論

近年，很多關(guān)于抗炎治療的臨床試驗(yàn)并沒有取得預(yù)期的結(jié)果，膿毒癥后并發(fā)癥的發(fā)病率和病死率依然持續(xù)升高［9]。目前研究人員的研究結(jié)果表明，作為一種晚期炎癥介質(zhì)，高遷移率族蛋白B1與膿毒癥的病理生理過程具有直接關(guān)系，屬于一種細(xì)菌和其毒素致死反應(yīng)的關(guān)鍵晚期細(xì)胞因子，其為進(jìn)一步研究膿毒癥的發(fā)病機(jī)制與干預(yù)方法提供了新的治療靶點(diǎn)［10]。

本研究結(jié)果表明，膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組患者淋巴細(xì)胞基因表達(dá)高遷移率族蛋白B1明顯升高。且隨著膿毒癥嚴(yán)重程度的加深，高遷移率族蛋白B1水平也明顯升高，提示高遷移率族蛋白B1水平與膿毒癥患者的嚴(yán)重程度具有直接的關(guān)系。目前關(guān)于膿毒癥患者的高遷移率族蛋白B1合成以及釋放的具體機(jī)制還沒有完全明確，推測(cè)可能與急性應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)菌內(nèi)毒素移位以及早期細(xì)胞因子具有直接關(guān)系［11]。膿毒癥病人在6～24 h內(nèi)，肝、肺及小腸組織的高遷移率族蛋白B1基因表達(dá)明顯升高，說明局部組織高遷移率族蛋白B1的產(chǎn)生與內(nèi)毒素介導(dǎo)的器官功能損傷具有密切的關(guān)系密切［12]。通過進(jìn)一步的研究表明，采取高遷移率族蛋白B1合成抑制劑能夠有效預(yù)防膿毒癥的發(fā)生發(fā)展并能對(duì)其發(fā)展過程進(jìn)行阻滯，并在不同程度上明顯改善組織的損傷程度以及緩解動(dòng)物預(yù)后情況。因此，高遷移率族蛋白B1這個(gè)“晚期”細(xì)胞因子可能與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展病具有直接關(guān)系，進(jìn)行及早的干預(yù)，可能有效的幫助膿毒癥的臨床治療，并減少致死率以及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［13]。本研究觀察到，與對(duì)照組進(jìn)行比較，膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組患者T淋巴細(xì)胞增殖明顯受到抑制。這表明膿毒癥患者的T細(xì)胞免疫功能受到十分嚴(yán)重的損傷，對(duì)患者的T淋巴細(xì)胞免疫功能進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，對(duì)監(jiān)測(cè)膿毒癥的病情的變化可能存在一定程度上的臨床意義。本研究還表明，與對(duì)照組進(jìn)行比較，膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組患者T淋巴細(xì)胞分泌IL-2水平明顯受到抑制。這表明在膿毒癥患者的外周血T淋巴細(xì)胞增殖能力與IL-2產(chǎn)生能力一直處在受抑制的狀態(tài)，其中以嚴(yán)重的膿毒血患者尤其明顯。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥病人的純化的CD8+T細(xì)胞增殖能力高于CD4+T細(xì)胞，推測(cè)可能與前列腺素刺激CD8+T細(xì)胞的生產(chǎn)、降低IL-2的水平以及阻滯T細(xì)胞增殖具有一定關(guān)系。高遷移率族蛋白Bl作為一種細(xì)胞核內(nèi)非組蛋白，全程參與了膿毒癥患者的病理發(fā)展過程，并成為膿毒癥潛在的重要干預(yù)靶點(diǎn)之一。然而，高遷移率族蛋白B1與機(jī)體免疫功能間的關(guān)系尚不清楚［14]。另外，丙酮酸乙酯能夠通過抑制高遷移率族蛋白B1的釋放從而緩解患者淋巴細(xì)胞的功能出現(xiàn)紊亂，即能夠明顯提升脾淋巴細(xì)胞的增殖能力以及IL-2的產(chǎn)生，從而有效緩解膿毒癥病人的細(xì)胞免疫功能障礙。

通過上述的研究結(jié)果表明，高遷移率族蛋白B1不僅屬于一類體內(nèi)關(guān)鍵的晚期促炎癥因子，而且還可能與膿毒癥病人的機(jī)體T細(xì)胞免疫功能紊亂具有一定程度上的關(guān)系，但其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究探討。