蔡筱蕾 沈玉潔 曹佳 徐雷鳴

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科（上海 200092）

胰腺癌是消化系統(tǒng)惡性程度極高的腫瘤，其五年生存率不足5%，缺少早期診斷及有效的干預(yù)手段是導致其高致死率的主要原因之一［1-2]。由于進展期胰腺癌的治療面臨常著傳統(tǒng)放化療不敏感、毒副作用大，分子靶向藥物耐藥，基因治療不完善等問題［3]，人類迫切需要尋找新的治療方法補充或替代傳統(tǒng)的治療方法。光動力療法（photodynamic therapy，PDT）是一種針對局部腫瘤的消融術(shù)，其在微創(chuàng)性、低毒性、對腫瘤的高親和性和幾乎可忽略的耐藥性等方面具有明顯優(yōu)勢［4]，是一種具有一定前景的胰腺癌治療手段。前期研究工作中，課題組成功合成一種新型光敏劑量子點（quantum dots，QDs）-RGD（arginine-glycine-aspartic peptide）生物熒光探針。已證實通過瘤內(nèi)注射量子點-RGD于裸鼠皮下胰腺癌移植瘤內(nèi)進行PDT，可增加光敏劑在胰腺癌組織的濃度、延長光敏劑在瘤體內(nèi)的滯留時間、顯著提高PDT療效，并減少光敏劑在其他器官的累積［5]。本研究目的在于探討量子點-RGD介導的光動力治療對胰腺癌侵襲的影響，為量子點-RGD在胰腺癌光動力治療中的作用及機制做進一步研究。

1 資料與方法

1.1 細胞株及實驗材料人胰腺癌細胞SW1990購于上海中國醫(yī)學科學院細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司，0.25%胰蛋白酶，胎牛血清均購于美國Gibco公司。量子點（Qdot?705 ITKTMCarboxyl Quantum Dots）購自 Thermo Fisher Scientific公司。RGD肽購自吉爾（上海）生化有限公司。EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）購自國藥集團化學試劑有限公司。Matrigel基質(zhì)膠購于美國BD公司。Transwell小室購于美國Corning公司。兔抗人單克隆抗體MMP2、兔抗人單克隆抗體MMP9均購于美國abcam公司。逆轉(zhuǎn)錄及real-time PCR試劑盒購于日本Takara公司。裸鼠普通飼料：上海新華醫(yī)院動物實驗平臺提供。4%多聚甲醛溶液：購自廣州賽國生物科技有限公司。

1.2 量子點-RGD的制備取50μL的羧基水溶性量子點（Qdot?705）于試管中，加入20 mmol/L，pH 7.4的硼酸鹽緩沖液稀釋至終濃度1μmol/L。加入偶聯(lián)劑EDC和RGD肽至上述溶液中室溫反應(yīng)2 h。反應(yīng)液通過脫鹽柱洗脫一次，收集有熒光的溶液，用超濾管（截留分子量50 kDa）超濾3次除去未反應(yīng)的RGD肽和其它雜質(zhì)，終產(chǎn)物濃縮并保存于50 mmol/L，pH 8.4硼酸緩沖液中。

1.3 細胞侵襲能力檢測將Transwell小室包被Matrigel基質(zhì)膠80μL（1∶4稀釋），37℃孵育6 h。在上室及下室均加入500μL無血清培養(yǎng)基4℃冰箱過夜。根據(jù)分組將處理后的細胞，消化離心，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞1次后，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞數(shù)為2×105/mL。每孔上室加入100μL，下室加入500μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48～60 h后，取出小室，棄上清，用棉簽擦去小室內(nèi)壁殘留細胞及Matrigel基質(zhì)膠。甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色10 min，晾干后將小室置于顯微鏡下拍照并隨機計算8個視野穿膜細胞數(shù)，取平均值。

1.4 Western blot法將處理后細胞培養(yǎng)至密度為90%時，消化離心，加入含有PMSF的蛋白裂解液，冰上放置45 min，4℃離心，取上清。采用BCA法進行蛋白濃度測定。取80μg總蛋白，配制10%聚丙烯酰胺凝膠，80 V電泳120 min。后300 mA轉(zhuǎn)膜100 min。使用含5%脫脂奶粉的TBST室溫搖床封閉2 h，TBST清洗3次，加入MMP2抗體（1∶500），MMP9抗體（1∶200）以及β-Actin抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜。次日，TBST清洗3次，加入相應(yīng)二抗（1∶1 000）室溫搖床孵育1 h，TBST清洗3次。ECL超敏發(fā)光液發(fā)光。

1.5 Real-time PCR法按照Takara公司相關(guān)試劑盒說明書抽提細胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA?；虮磉_通過2-△△Ct法分析方法進行計算。實驗重復3次。引物：MMP2上游：ATGAAGCACAGCAGGTCTCA；MMP2下游：TGAAGCCAAGCGGTCTAAGT；MMP9上游：CGGACCAAGGATACAGTTTGTT；MMP9下游：GTTCAGGGCGAGGACCATAG；β-Actin上游：TCCTTCCTGGGCATGGAGT；β-actin下游：CAGGAGGAGCAATGATCTTGAT。

1.6 裸鼠皮下成瘤及PDTSW1990細胞在37℃、5%CO2飽和濕度無菌培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。將5×105腫瘤細胞0.2 mL接種于5周齡BALB/c-nu/nu裸鼠背側(cè)皮下，建立腫瘤模型，密切觀察腫瘤生長情況。待3周后腫瘤長至0.5～0.8 cm3，將裸鼠分為4組，每組3只。第一組瘤內(nèi)注射5 pmol量子點-RGD，應(yīng)用注射針頭插入瘤體內(nèi)，將光導纖維插入針頭，給以PDT激光治療機的激光照射；第二組瘤內(nèi)注射5 pmol量子點-RGD，不予以PDT照射；第三組未瘤內(nèi)注射任何試劑，應(yīng)用注射針頭插入瘤體內(nèi)，將光導纖維插入針頭，給以PDT激光治療機的激光照射；第四組空白對照。兩周后重復上述過程，觀察腫瘤生長及侵襲情況。

1.7 免疫組化觀察期結(jié)束后，用頸椎脫臼法處死裸鼠，無菌條件下取出腫瘤組織，腫瘤組織以10%甲醛固定并制成病理切片。將移植瘤切片進行免疫組化染色，將石蠟切片脫蠟至水，后EDTA抗原修復緩沖液進行抗原修復。放入3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清室溫封閉30 min，加一抗，加二抗，使用DAB顯色法顯色。Harris蘇木素復染細胞核，后脫水封片。顯微鏡下觀察殘存細胞MMP2、MMP9的表達情況，圖像采集分析。

1.8 統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料均以均數(shù)±標準差表示，實驗重復3次。兩組實驗均數(shù)比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 量子點-RGD-PDT存活SW1990腫瘤細胞的侵襲能力增強通過體外細胞侵襲-Transwell法模擬體內(nèi)侵襲過程，測定腫瘤細胞侵襲人工基底膜的能力，可以間接反映腫瘤細胞體內(nèi)侵襲能力。結(jié)果顯示，各組穿過人工基底膜的細胞數(shù)量如下：空白對照組20.875±3.551、量子點-RGD組23.375±2.233、單光照組24.250± 2.681、量子點-RGDPDT組62.625±7.088。比較各組細胞數(shù)量結(jié)果顯示，與空白對照組比較，量子點-RGD-PDT組存活SW1990腫瘤細胞轉(zhuǎn)移到膜下表面的明顯增多，約為對照組的3倍（圖1），其差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。

圖1 量子點-RGD介導PDT增強SW1990胰腺癌細胞體外侵襲能力Fig.1 QDs-RGDinduced PDTto enhance the ability of invasion on SW1990 cells.

2.2 量子點-RGD-PDT存活SW1990腫瘤細胞的MMP2及MMP9表達增強MMP2、MMP9能夠降解基底膜和細胞外基質(zhì)中的主要成分Ⅳ型膠原，與腫瘤的浸潤關(guān)系最為密切。本研究采用Realtime PCR檢測細胞MMP2及MMP9的mRNA表達（圖2），用Western blot方法檢測了細胞內(nèi)的MMP2及MMP9蛋白的表達（圖3A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)量子點-RGD-PDT后存活的SW1990腫瘤細胞的MMP2及MMP9的mRNA表達均增高（P＜0.05），約為對照組的2.09倍及1.7倍（圖2）。細胞的MMP2及MMP9的表達蛋白也相應(yīng)均增高（P＜0.05），約為對照組的1.9倍及3.76倍（圖3 B）。

圖2 Real-time PCR檢測量子點-RGD-PDT后MMP2和MMP9表達的影響Fig.2 Real-time PCR detected the effects of QDs-RGD mediated PDTon MMP2 and MMP9 expression

圖3 Western blot檢測量子點-RGD-PDT后MMP-2和MMP-9表達的影響Fig.3 Western blot detected the effects of QDs-RGDmediated PDT on MMP-2 and MMP-9 expression.

2.3 量子點-RGD-PDT后存活SW1990腫瘤細胞的體內(nèi)侵襲能力增強將SW1990細胞接種于5周齡裸鼠背側(cè)皮下，建立腫瘤模型。3周后，長至0.5～0.8 cm3，將裸鼠分為4組，給予相應(yīng)處理。2周后，重復處理一次。觀察期結(jié)束后，頸椎脫臼法處死裸鼠，無菌條件下取出腫瘤組織，制成病理并切片進行免疫組化染色，檢測存活SW1990細胞MMP2及MMP9表達情況。結(jié)果顯示，量子點-RGD-PDT后存活的SW1990腫瘤細胞的MMP2及MMP9的表達均增高（圖4）。

3 討論

圖4 免疫組織化學染色檢測量子點-RGD-PDT后移植瘤組織MMP2及MMP9蛋白表達的情況（×40）Fig.4 Immunohistochemical detected the effects of QDs-RGD mediated PDT on MMP2 and MMP9 expression（× 40）

胰腺癌是一種兇險的惡性腫瘤，五年生存率不到5%，在歐美國家惡性腫瘤病死率排第4位，每年約有10萬人死于胰腺癌［6]。目前主要的治療手段是根治性手術(shù)切除［7]。經(jīng)過長期研究，胰腺癌在早期診斷和放化療單獨或聯(lián)合應(yīng)用方面雖有一定進展，但生存率仍然不理想［8]。光動力治療被認為是治療各種癌癥和血管增生性疾病非常有前景的新方法。其原理是利用光敏劑選擇性聚積、滯留于腫瘤組織，并在特定波長光照下，通過光化學或光生物學反應(yīng)對瘤組織產(chǎn)生殺傷效應(yīng)，從而達到局部治癌的目的［9]。胰腺為腹膜后器官且為乏血供腫瘤，因此使用傳統(tǒng)光敏劑介導的光動力治療效果不佳［10]。因此，筆者期望能開發(fā)出更合適的光敏劑，以用來提高PDT的治療效率。

量子點是一種特殊納米材料，顆粒直徑一般＜10 nm，由Ⅱ～Ⅳ族元素或ⅢⅤ族元素組成［11]。量子點受激后可發(fā)射熒光以及介導PDT殺傷腫瘤細胞，具有激發(fā)光譜寬和發(fā)射光譜窄等優(yōu)點。RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的短肽，對多種腫瘤細胞上整合素 αvβ3（integrin αvβ 3）受體具有很好的靶向性［12]。筆者將RGD偶聯(lián)量子點制成生物探針，使量子點更穩(wěn)定、生物相容性更好，并且增加光敏劑在胰腺腫瘤內(nèi)的聚集濃度及滯留時間，從而使增強光動力作用效果。根據(jù)前期研究，量子點-RGD已經(jīng)被證明在體外實驗中可作為新型光敏劑應(yīng)用于對胰腺癌的光動力治療研究中［13]，并且體內(nèi)體外實驗證明量子點-RGDPDT可使胰腺癌細胞凋亡［5，14]。

相關(guān)研究證實PDT可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)、局部炎癥反應(yīng)以及血管損傷等，這些反應(yīng)可導致血管生長因子、細胞因子等表達增加，這些因子的激活與腫瘤復發(fā)有關(guān)［15-16]。目前大多數(shù)關(guān)于新型光敏劑的研究僅關(guān)注是否導致胰腺癌細胞凋亡，而忽視殘存胰腺癌細胞的情況。而大多侵襲研究集中于光動力治療后短期內(nèi)腫瘤細胞生物學特性的變化，而忽視其遠期效應(yīng)，缺乏長期動態(tài)的研究。這也可以部分解釋為什么有的研究結(jié)果顯示光動力治療后腫瘤細胞的侵襲潛能增加，而有的研究卻發(fā)現(xiàn)其侵襲潛能降低。腫瘤細胞的侵襲包括一系列復雜的過程，MMPs是一類高度保守的鋅離子依賴內(nèi)肽酶家族，大部分能降解基膜成分和ECM，基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）是所有MMPs中分布最廣的，位于腫瘤細胞質(zhì)膜上，是MMPs激活過程中的關(guān)鍵酶之一［17]。FERRARIO等［18]研究顯示，光動力治療乳腺腫瘤24 h后，MMP9表達明顯增加，MMP1，MMP3和MMP8也出現(xiàn)表達增加的情況。采用光動力治療與MMPs抑制劑TIMP-1聯(lián)合應(yīng)用后，能改善乳腺腫瘤的治療效果。因此，就新型光敏劑量子點-RGD而言，不僅需要研究其對胰腺癌細胞生存的影響，也需要研究對胰腺癌細胞侵襲潛能的影響。

量子點-RGD-PDT后存活的SW1990胰腺癌細胞侵襲性變化有待于進一步探索。鑒于此，筆者采用SW1990胰腺癌細胞系設(shè)計體外細胞實驗以及構(gòu)建皮下移植瘤裸鼠模型，觀察并研究量子點-RGD-PDT后存活的SW1990胰腺癌細胞侵襲潛能的變化。在體外實驗中，利用包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室檢測腫瘤細胞的侵襲情況。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組比較，量子點-RGD-PDT組侵襲力上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而單純光照組和量子點-RGD組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。提示量子點-RGD-PDT后存活SW1990腫瘤細胞的侵襲能力增強。此外，本研究提取PDT治療后的SW1990細胞的總蛋白及總RNA，應(yīng)用Western blot及Real-time PCR技術(shù)了解侵襲相關(guān)蛋白MMP2及MMP9的表達情況。筆者發(fā)現(xiàn)量子點-RGD-PDT后殘存SW1990胰腺癌細胞MMP2及MMP9的mRNA及蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。在體內(nèi)實驗中，本研究建立裸鼠皮下移植瘤模型，瘤內(nèi)注射量子點-RGD后行PDT，觀察腫瘤生長及侵襲情況，移植瘤進行免疫組化染色，觀察細胞侵襲相關(guān)蛋白MMP2及MMP9的表達。結(jié)果顯示，量子點-RGD-PDT組移植瘤殘存細胞MMP2及MMP9表達較其他組明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。提示量子點-RGD-PDT后存活SW1990腫瘤細胞的浸潤能力增強可能與誘導MMPs表達增強有關(guān)。

不同胰腺癌細胞系其生物學特性并非完全相同，不同的光敏劑，不同的光照時間及光照能量可能導致腫瘤細胞產(chǎn)生不同的生物學效應(yīng)，對于其他胰腺癌細胞系而言，是否會誘導細胞侵襲性增強、量子點-RGD-PDT使胰腺癌細胞侵襲性增強的光照時間、光照能量仍需進一步探討。

綜上所述，量子點-RGD介導光動力治療后SW1990胰腺癌細胞侵襲潛能增強，誘導胰腺癌細胞MMP2和MMP9蛋白表達增加是侵襲潛能增強的原因之一。