韓金鑫

(天津冶金職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300400)

碳酸鹽巖在自然界中廣泛分布，在碳酸鹽巖的表面具有多種多樣的微生物存在[1]，微生物的新陳代謝及生命活動(dòng)對(duì)碳酸鹽巖的風(fēng)化、表面形貌及周邊環(huán)境都有重要影響。白云巖作為典型的碳酸鹽巖，其表面分布著多種重要的微生物[2]。微生物的生長(zhǎng)繁殖及其代謝活動(dòng)不僅可以加速巖石礦物的風(fēng)化，還可以促進(jìn)或誘導(dǎo)礦物的合成[3]。惡臭假單胞菌作為白云巖表面的優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)其具有重要的礦化作用[4]。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，依賴于DNA的系統(tǒng)發(fā)育的多樣性研究已經(jīng)成為微生物多樣性研究的重要代表[5]。微生物種類繁多，各種微生物具有各自獨(dú)特的酶系統(tǒng)，因而對(duì)底物的分解能力不同，其代謝產(chǎn)物也不同。用生物化學(xué)方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物，可用來(lái)區(qū)別和鑒定細(xì)菌的種類[6]。利用生物化學(xué)方法來(lái)鑒別不同細(xì)菌，稱為細(xì)菌的生物化學(xué)試驗(yàn)或稱生化反應(yīng)。生理生化實(shí)驗(yàn)的方法很多，本文主要研究對(duì)該菌株具有判斷影響的幾種實(shí)驗(yàn)。本文選用分離自白云巖表面的惡臭假單胞菌作為實(shí)驗(yàn)菌株。將其編號(hào)為DCB13菌株。

1 材料與方法

1.1 惡臭假單胞菌的采集

白云巖樣品采集自貴州省貴陽(yáng)市云巖區(qū)阿哈水庫(kù)旁，選擇表面微生物豐富的白云巖礦物，以地質(zhì)錘鑿取巖石礦物，除去污染部分后收集在無(wú)菌袋中保存。

在實(shí)驗(yàn)室中用無(wú)菌水清洗數(shù)次，刮取表面微生物在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)數(shù)天，待其大量繁殖后，挑取生長(zhǎng)旺盛的疑似惡臭假單胞菌的單菌落，經(jīng)過(guò)數(shù)次純化培養(yǎng)后待用，將其編號(hào)為DCB13菌株。

1.2 生理生化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)伯杰細(xì)菌手冊(cè)[7]、常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[8]、一般細(xì)菌常用鑒定方法及環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[9]等，對(duì)DCB13菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定。

主要實(shí)驗(yàn)包括：(1)氧化酶實(shí)驗(yàn)；(2)過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)；(3)淀粉水解實(shí)驗(yàn)；(4)吲哚實(shí)驗(yàn)；(5)甲基紅實(shí)驗(yàn)(M.R.實(shí)驗(yàn))；(6)乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)(V-P實(shí)驗(yàn))；(7)利用檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)；(8)產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)；(9)硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)；(10)葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

1.3 DNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)

1.3.1 DNA提取

參照分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南的方法[10]，提取基因組DNA。

1.3.2 16S rDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)

選用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)、引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)、引物T7 promotor (5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)及引物SP6 promotor(5′-ACGATTTAGGTGACACTATAG-3′)。

PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 5 μL，MgCl2(25 mmol/L) 4 μL，Taq DNA 聚合酶(5U/μL) 0.5 μL，dNTPMixture(各 2.5 mmol/L) 4?L，27F(10 μmol/L) 2μL，1492R(10 μmol/L) 2μL，模板DNA 1μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50μL。

PCR反應(yīng)條件：先94 ℃ 5min，再94 ℃ 1min、52 ℃ 1min和72 ℃ 2min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10min。

取PCR產(chǎn)物5.0 μL于1.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.3.3 DNA測(cè)序

測(cè)序工作由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

氧化酶實(shí)驗(yàn)中在培養(yǎng)基中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，菌苔8s呈紅色，測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性(+)；過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，滴加H2O2有氣泡產(chǎn)生，測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性(+)；淀粉水解實(shí)驗(yàn)中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，菌苔周圍無(wú)透明圈出現(xiàn)，測(cè)試結(jié)果為陰性(-)；吲哚實(shí)驗(yàn)中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，溶液呈紅色，測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性(+)；甲基紅實(shí)驗(yàn)(M.R.實(shí)驗(yàn))中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，溶液呈無(wú)色，測(cè)試結(jié)果為陰性(-)；乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)(V-P實(shí)驗(yàn))中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，培養(yǎng)液不呈紅色，測(cè)試結(jié)果為陰性(-)；利用檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)中接入惡臭假單胞菌DCB13菌種，培養(yǎng)基顏色變?yōu)樗{(lán)色，測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性(+)；產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，使濾紙條不變黑，測(cè)試結(jié)果為陰性(-)；葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中接入惡臭假單胞菌DCB13菌株，試管中顏色由上向下變色，屬氧化型。

2.2 DNA測(cè)序?qū)嶒?yàn)結(jié)果

用引物擴(kuò)增DCB13的16S rRNA基因，基因片段如下：

確定該DCB13菌株為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)，其GenBank登陸序列號(hào)JN650551。

3 結(jié)論

(1)通過(guò)對(duì)白云巖表面微生物的采集、培養(yǎng)、純化可得到惡臭假單胞菌。

(2)對(duì)該菌株進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)(M.R.實(shí)驗(yàn))、乙酰甲基甲醇實(shí)驗(yàn)(V-P實(shí)驗(yàn))、利用檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)H2S實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可初步判斷該菌株為惡臭假單胞菌。

(3)通過(guò)對(duì)該菌株進(jìn)行DNA測(cè)序，確定該菌株為惡臭假單胞菌。

(4)通過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn)可對(duì)未知菌株進(jìn)行初步判斷，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)和幫助。

(5)在白云巖表面存在著惡臭假單胞菌等優(yōu)勢(shì)菌株，他們的繁殖和代謝活動(dòng)會(huì)對(duì)碳酸鹽巖的風(fēng)化和表面形貌的形成產(chǎn)生重要作用。