李 敏，王德民，馮甜甜，李 峰，馮 帥

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355)

中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性的一種方法[1]。高效液相色譜法是目前中藥材質(zhì)量檢測應(yīng)用最廣泛的方法，該方法具有分離效率高、分析速度快、精密度高、檢測器類型多、方法穩(wěn)定性好等諸多特點，而且對樣品無揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性方面的限制，比氣相色譜法應(yīng)用要廣泛的多，中藥材中絕大多數(shù)的化學(xué)成分均可釆用該方法進行分析，是目前構(gòu)建中藥指紋圖譜的主要方法[2]。目前，市售連翹藥材的產(chǎn)地加工方法有生曬、蒸、煮三種，不同的產(chǎn)地與加工方法使得連翹藥材質(zhì)量差異較大。本研究目的是為連翹藥材質(zhì)量的評價提供實驗依據(jù)，故選擇了藥材含量豐富的50%甲醇提取液，對連翹藥材進行了HPLC指紋圖譜分析。

1 試劑、儀器與樣品

1.1 試劑 、儀器

高效液相色譜儀(檢測器型號：UV-L2400，日立公司)；色譜柱(VP-ODS柱，粒度5μm，150 mm×4.6 mm，美國安捷倫科技公司)；乙醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司，批號：20160924)；甲醇(色譜純，天津市四友卓越科技有限公司，批號：Q/BSYZ01-2016)；磷酸(分析純，天津科工工貿(mào)有限公司，批號：150821)；乙腈(色譜純，美國TEDIA)；純凈水(娃哈哈公司)；連翹苷標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110821-201112，純度96.8%)；連翹脂苷A標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111810-201112，純度92.9%)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號：111810-201109，純度90.5%)[2]。

1.2 供試藥材

表1 采集供試藥材列表

表2 市售供試藥材列表

采集12份連翹藥材，購買的6批市售藥材均經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室李峰教授鑒定，符合《中國藥典》2015年版一部規(guī)定，為正品青翹[3]。見表1、2[4]。參考《中華人民共和國藥典》藥材炮制通則中蒸法、煮法項下炮制。參考鄭伶俐的《陜西道地藥材連翹炮制工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究》中正交實驗法優(yōu)選出的連翹產(chǎn)地炮制最佳工藝進行實驗藥材的炮制[5]。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品提取溶劑的優(yōu)選

圖1 不同提取溶劑提取液的HPLC色譜圖

連翹藥材經(jīng)40目篩粉碎成粗粉，精密稱取藥材粉末0.5 g，分別用15 mL水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚為提取溶劑，超聲振蕩提取30min，過濾，后利用旋蒸揮干溶劑，以甲醇定容至10 mL。用0.45 μm微孔濾膜濾過后進行HPLC分析，條件：流速1 mL/min，吸收波長270 nm，記錄60min的色譜圖，見圖1。結(jié)果顯示甲醇當(dāng)提取溶劑提取的色譜峰數(shù)目較多，峰強度較高。所以進一步將25%、50%、75%、100%甲醇作為提取溶劑，篩選得出50%甲醇為溶劑時各峰信號值最高，見圖2。因此選擇50%的甲醇為最終的提取溶劑[6]。

圖2 不同濃度甲醇提取液的HPLC圖譜比較

2.2 供試品提取時間的選擇

圖3 不同提取時間的提取液HPLC色譜圖比較

精密稱取連翹藥材粉末0.5g，加入15mL50%甲醇，超聲震蕩提取。提取時間分別為20、30、40、50min，依上述條件進行液相測定，記錄60min的色譜圖，篩選得出超聲提取30min時各峰信號值最高，見圖3。所以最終以超聲30min為提取時間。

2.3 高效液相色譜條件的選擇

2.3.1 檢測波長的選擇

以上述優(yōu)選出的提取溶劑制備樣品液，采用乙腈和水梯度洗脫，進行190～400 nm全波長掃描檢測[5]。掃描結(jié)果見圖4。參照全波長掃描結(jié)果，選擇能夠較多的顯示連翹化學(xué)成分信息的幾個檢測波長，進一步進行波長優(yōu)選。如圖5，依次為：219、235、270、290 nm。后對上述四個波長進行進一步的優(yōu)選，根據(jù)結(jié)果，選擇檢測波長為235 nm。

圖4 連翹50%甲醇提取液的HPLC3D光譜圖

圖5 檢測波長的選擇

2.3.2 流動相的選擇

精密稱取0.5 g藥材粉末，加入15mL50%甲醇，超聲提取30min，分別以甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水為流動相，柱溫25℃，流速1 mL/min，進樣量20μL，檢測波長235 nm，記錄60min色譜圖，結(jié)果如圖6所示。可見，以乙腈為流動相的色譜峰數(shù)較甲醇的色譜峰多，以0.1%磷酸水為流動相的色譜峰分離度較好，因此將流動相定為乙腈-0.1%磷酸水[6]。

圖6 不同流動相的HPLC色譜圖比較

2.3.3 柱溫的選擇

圖7 不同溫度下的HPLC色譜圖比較

以上述優(yōu)選條件進行試驗，后分別取柱溫20、25、30、35℃進行液相測定，HPLC條件為流速1 mL/min，進樣量20μL，檢測波長235 nm，記錄60min所得色譜圖，色譜圖如圖7所示?？梢?，當(dāng)柱溫上升到30℃時色譜峰的分離度最好，因此最終將柱溫定為30℃。

2.4 連翹HPLC色譜條件的確定

連翹藥材粉碎過40目篩，精密稱取藥材粉末0.5 g置于錐形瓶中，以50%甲醇15 mL超聲提取30min，0.45μm微孔濾膜過濾，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸水為流動相，梯度洗脫條件見表3，柱溫30℃，流速1 mL/min，進樣量20μL，檢測波長235 nm。色譜圖見圖8、9。

表3 梯度洗脫條件

2.5 對照品實驗

取適量的連翹苷、連翹酯苷A、蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)品，以50%甲醇溶解，取20μL，按照優(yōu)選的HPLC色譜條件洗脫，確定對照品的位置，記錄色譜圖，見圖8[7]。

圖8 對照品與連翹HPLC色譜圖的比對

2.6 方法學(xué)考察

同一樣品在同一色譜條件下的相對保留時間(RRT)、相對積分面積比值(RA)相對固定，是中藥HPLC指紋圖譜的兩個核心參數(shù)，可以作為指紋圖譜評價的重要變量。以出峰時間、峰面積較為穩(wěn)定，且通過標(biāo)準(zhǔn)品對照確定為連翹苷的色譜峰作為參照峰，進行其他色譜峰RRT、RA的計算[8]。

2.6.1 精密度試驗

精密稱取樣品粉末0.5 g，按上述色譜條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積占總峰面積2%以上的色譜峰的相對保留時間及峰面積。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積1%以上的色譜峰25個，其相對保留時間的RSD值為0.0104%～0.0461%，峰面積的RSD值為0.9622%～2.6353%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求[9]。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗

精密稱取樣品粉末0.5g，按上述色譜條件，分別在0，2，4，6，8，10 h進樣。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積1%以上的色譜峰25個，其相對保留時間的RSD值為0.0106%～0.3718%，峰面積的RSD值為0.6085%～2.5809%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.6.3 重現(xiàn)性試驗

精密稱取樣品粉末0.5 g共6份，分別按上述色譜條件測定。結(jié)果表明，峰面積占總峰面積1%以上的色譜峰25個，其相對保留時間的RSD值為0.0136%～0.9122%，峰面積的RSD值為0.7097%～2.9175%，均在3%以內(nèi)，符合指紋圖譜技術(shù)要求[10]。

2.7 結(jié)果

2.7.1 12批不同產(chǎn)地連翹藥材的檢測

按2.4法，對12批不同產(chǎn)地的連翹藥材(經(jīng)蒸、煮、生曬加工共22個樣)進行HPLC檢測，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》[11]對所得HPLC圖譜進行了共有峰的比對和標(biāo)定，20個共有峰，見圖9、10，共有峰保留時間見表4。所有樣品的共有峰面積和均占總峰面積的90%以上。

圖9 不同產(chǎn)地不同加工方式連翹藥材的HPLC色譜圖比對

圖10 連翹HPLC對照譜圖

編號保留時間/min相對保留時間編號保留時間/min相對保留時間15.8830.0951138.7880.624210.2400.1651239.8870.642312.4810.2011345.1360.727420.0240.3221448.9570.788526.3310.4241554.3000.874633.6090.5411662.1151.000734.3000.5521766.8891.077835.8260.5771883.4691.344936.6330.5901991.9681.4811037.7030.6072095.2611.534

2.7.2 6批市售連翹的檢測

按照前述的HPLC色譜條件，對6批市售連翹藥材進行檢測，繪制的HPLC如圖11。

圖11 不同產(chǎn)地市售連翹藥材的HPLC色譜圖

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》，以前期試驗所得的HPLC對照指紋圖譜譜圖為參照，對所得HPLC圖譜進行了共有峰的比對和標(biāo)定，結(jié)果見圖12[12]。6批藥材所得的HPLC色譜圖與前期得到的連翹藥材HPLC對照指紋圖譜的相似度評價，見表5。結(jié)果顯示，6批市售藥材與已知HPLC對照指紋圖譜的相似度均>0.90，可見前期試驗所得的HPLC對照指紋圖譜對于連翹藥材的鑒別具有很好的應(yīng)用性。

1 HPLC對照指紋圖譜，2 河北，3河南，4 濟南，5 山西，6 陜西，7 泰山

3 小結(jié)與討論

3.1 連翹HPLC色譜條件的選擇

3.1.1 提取溶劑的選擇

本次實驗通過選用不同的提取溶劑，即水、甲醇(25%、50%、75%、100%)、乙腈、乙酸乙酯、石油醚等，從而篩選得出以50%的甲醇做提取液時所得到的色譜峰數(shù)目較多，而且各峰信號值也較高。所以，最終確定以50%甲醇為提取溶劑，結(jié)果顯示連翹樣品50%甲醇提取液能夠較好的反應(yīng)其整體的化學(xué)成分，也能夠較全面地反映出其所含化學(xué)成分濃度分布的狀況。

3.1.2 洗脫溶劑的選擇

連翹的50%甲醇提取液的成分比較復(fù)雜，所以單一的使用一種流動相很難實現(xiàn)很好的分離效果，因此本實驗采用了梯度洗脫的方式。通過初步研究，得出乙腈作為流動相的色譜峰大于甲醇的色譜峰，以0.1%磷酸作為流動相分離色譜峰優(yōu)于單乙腈。在分析過程中，發(fā)現(xiàn)在運行時間為10min時，色譜峰不完全分離，如果5%乙腈洗脫，則會出現(xiàn)峰積累現(xiàn)象。所以這一部份應(yīng)選擇洗脫性比乙腈弱的甲醇為流動相。從而使樣品能夠得到良好的分。經(jīng)過多次反復(fù)實驗，最終確用流動相為乙腈-0.1%磷酸水進行梯度洗脫[15 ]。

3.1.3 檢測波長的選擇

在本實驗中，比較了不同波長檢測的HPLC譜峰的色譜峰數(shù)、分離度和吸收強度。結(jié)果，隨著檢測波長的提高，連翹提取液的HPLC色譜峰信息會越來越稀少。經(jīng)過進一步比較優(yōu)化，篩選出最佳檢測波長，即以235 nm作為檢測波長[16]。

3.1.4 洗脫溫度的選擇

本次實驗以5℃為梯度分別取柱溫20～30℃進行了HPLC檢測，結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為30℃時，各色譜峰的分離效果較好。但柱溫升高至35℃時，色譜峰出現(xiàn)堆疊,分離效果變差。經(jīng)綜合分析后，最終確定柱溫為30℃。綜上，經(jīng)反復(fù)比較優(yōu)選，最終確定了連翹指紋圖譜的研究條件。

3.2 討論

3.2.1 不同產(chǎn)地加工方式連翹的HPLC圖譜分析

本研究對經(jīng)三種產(chǎn)地加工處理的三批連翹藥材生曬品、蒸品、煮品進行了HPLC檢測，比對結(jié)果顯示三種產(chǎn)地加工品的HPLC圖譜相似性較高；顯示蒸、煮加工雖然會導(dǎo)致有些化學(xué)成分的損失、降解或性質(zhì)的改變，但主化學(xué)成分未發(fā)生變化[17]。因此，本研究確定的連翹HPLC指紋圖譜對連翹藥材具有很好的適用性、推廣性。

3.2.2 連翹HPLC指紋圖譜的適用性研究

利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》，以研究建立的連翹HPLC指紋圖譜方法，對6批市售連翹藥材所得的HPLC色譜圖進行了鑒別和相似度評價[18]。結(jié)果顯示，6批市售藥材與已知HPLC對照指紋圖譜的相似度均>0.90，可見前期試驗所得的連翹HPLC對照指紋圖譜對于連翹藥材的鑒別具有很好的應(yīng)用性[9]。

由此可得出結(jié)論本次實驗所得的連翹的指紋圖譜能夠比較全面的反映連翹中各種化學(xué)成分的分布情況，且能從總體上反映連翹藥材的質(zhì)量和品質(zhì)的優(yōu)劣。