董海霞，蔡連輝，張曼紅，劉建洋

(山東標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)有限公司，山東 濟(jì)南 250101)

瑞戈非尼(regorafenib，1)[1]，化學(xué)名為4-[4-({[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰}氨基)-3-氟苯氧基]-N-甲基吡啶-2-甲酰胺一水合物，拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)的瑞戈非尼片(商品名：STIVARGA?)，2012年9月在美國(guó)上市[2]，用于治療先前接受過(guò)伊馬替尼和舒尼替尼治療的局部晚期，不能手術(shù)切除或轉(zhuǎn)移性胃腸道間質(zhì)瘤(GIST)患者。1是由德國(guó)拜耳公司研發(fā)的一種具有口服活性的新型二苯脲類廣譜激酶抑制劑，通過(guò)抑制促進(jìn)腫瘤組織生長(zhǎng)的多種酶(包括VEGFR-1、VEGFR-、VEGFR-3、PDGFR-β、FGFR1和c-KIT等)，進(jìn)而起到抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞增殖的作用[3-5]。本試驗(yàn)建立了反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定瑞戈非尼的有關(guān)物質(zhì)，此法靈敏度高，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，可用于瑞戈非尼的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA檢測(cè)器和Empower 3工作站)；QUINTIX125D-1CN電子分析天平(賽多利斯公司)；FE-28臺(tái)式酸度計(jì)(梅特勒-托利多儀器)。

1.2 試藥

瑞戈非尼樣品(批號(hào)：170628、170714、170726)，由本公司生產(chǎn)；雜質(zhì)A對(duì)照品(批號(hào)：ZA170301，含量：98.3%，化學(xué)名：4-(4-氨基-3-氟)苯氧基-N-甲基-2-吡啶羧酰胺)；雜質(zhì)B對(duì)照品(批號(hào)：ZB170401，含量：99.3%，化學(xué)名：1,3-二(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲)；雜質(zhì)C(批號(hào)：ZC170301，含量97.8%，化學(xué)名：4-[2-氟-4-[2-(甲胺?；?吡啶-4-氨基]苯氧基]-N-甲基-吡啶-2-酰胺)；雜質(zhì)D對(duì)照品(批號(hào)：ZD170401，含量：99.3%，化學(xué)名：4-氯-3-(三氟甲基)苯胺)；雜質(zhì)E對(duì)照品(批號(hào)：ZE170301，含量：96.0%，化學(xué)名：4-(4-(3-(4-氯-3-三氟甲基苯基)脲基)-3-氟苯氧基)-2-甲胺?；拎?1-氧化物)均為本公司自制；乙腈(色譜純，ASTOON，4L/瓶)；醋酸銨(色譜純，飛世爾，500g/瓶)；水為市售純凈水(杭州哇哈哈集團(tuán))。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性

色譜柱Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，以0.05 mol·L-1醋酸銨溶液-乙腈(80:20)為流動(dòng)相A，以0.05 mol·L-1醋酸銨溶液-乙腈(10:90)為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～10min，70%A；10～12min，70%A→48%A；12%～35min，48%A；35～40min，48%A→15%A；40～50min，15%A；50～60min，15%A→70%A；60～65min，70%A)，流速1.0mL·min-1，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm，進(jìn)樣量20μL。在本色譜條件下，瑞戈非尼保留時(shí)間約為31.5min，雜質(zhì)A保留時(shí)間約為6.8min，雜質(zhì)B保留時(shí)間約為47.4min，雜質(zhì)C保留時(shí)間約為7.3min，雜質(zhì)D保留時(shí)間約為19.7min，雜質(zhì)E保留時(shí)間約為20.9min，理論板數(shù)按瑞戈非尼峰計(jì)為10157，雜質(zhì)E與瑞戈非尼的分離度為25.2；雜質(zhì)A與雜質(zhì)C的分離度為1.8；雜質(zhì)D與雜質(zhì)E的分離度為4.6，均分離完全。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖

2.2 專屬性試驗(yàn)

精密稱取瑞戈非尼粉末約20 mg，置50 mL量瓶中，進(jìn)行不同條件下的降解試驗(yàn)。酸破壞：加2 mol·L-1鹽酸溶液，100℃水浴條件下，放置2 h后，用堿中和；堿破壞：加2 mol·L-1氫氧化鈉溶液，100℃水浴條件下，放置3 h后，用酸中和；氧化破壞：加入30%過(guò)氧化氫溶液2 mL，100℃水浴條件下，放置12 h；高溫破壞：100℃水浴條件下，放置8 h；光照：在光強(qiáng)度4500lx下照射24 h。按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，用DAD檢測(cè)器掃描，得到色譜圖，見(jiàn)圖2、3。圖譜顯示產(chǎn)生的降解物質(zhì)與主峰的分離度均大于1.5，能完全分離，表明該法的專屬性較強(qiáng)；根據(jù)DAD掃描的光譜圖，可知主峰為單一純度峰，且主成分和主要降解產(chǎn)物在檢測(cè)波長(zhǎng)261 nm處均有吸收，說(shuō)明在選定色譜條件下可以檢出樣品中可能存在的雜質(zhì)。

圖2 酸、堿與高溫破壞色譜圖

圖3 未破壞、氧化及光照破壞色譜圖

2.3 線性試驗(yàn)及校正因子

配制相當(dāng)于供試品溶液濃度的0.02%、0.04%、0.06%、0.1%、0.15%的線性溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸；同時(shí)計(jì)算各雜質(zhì)的檢測(cè)限(LOD)、定量限(LOQ)和校正因子，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果及LOD、LOQ和校正因子

注：[1]r>0.999。

2.4 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品，由2名實(shí)驗(yàn)人員在不同時(shí)間、不同設(shè)備上，分別測(cè)定6份供試品溶液；計(jì)算得雜質(zhì)A、B、C、D、E、最大單一雜質(zhì)和總雜質(zhì)含量的RSD(n=12)分別為2.6%、2.0%、3.5%、4.1%、2.8%、3.2%和1.1%。

取新鮮配制的對(duì)照品溶液和供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，對(duì)照品溶液中主峰面積各時(shí)間點(diǎn)與零點(diǎn)比較變化值最大為3.1%，均小于5.0%；供試品溶液中各雜質(zhì)含量和總雜質(zhì)含量變化均小于0.02%，表明，室溫條件下，對(duì)照品溶液和供試品溶液均在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 回收率試驗(yàn)

取瑞戈非尼適量，加溶劑制成每1 mL中含0.4 mg的溶液，分別加入0.2%、1.0%與1.5%的雜質(zhì)對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算。結(jié)果雜質(zhì)A、B、C、D、E的平均回收率(n=9)分別為98.4%、102.7%、97.3%、97.9%、104.2%，RSD分別為1.3%、2.4%、2.8%、1.2%和1.5%。

2.6 樣品測(cè)定

取3批自制產(chǎn)品和1批原研藥，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，雜質(zhì)A、B、C、D、E分別按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，其他雜質(zhì)按主成分自身對(duì)照法計(jì)算。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果/%

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)合成工藝中各起始原料、各中間體、雜質(zhì)A、B、C、D、E、瑞戈非尼的紫外掃描圖譜及樣品強(qiáng)制降解試驗(yàn)中的各降解產(chǎn)物的二極管陣列檢測(cè)器的掃描圖譜，發(fā)現(xiàn)使用261 nm波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可將各雜質(zhì)成分有效檢出，分離度良好。故最終選擇261 nm為本試驗(yàn)檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)分別以乙腈-0.05mol·L-1醋酸銨溶液不同比例的溶液作為流動(dòng)相A和B，并對(duì)流動(dòng)相系統(tǒng)的洗脫方式進(jìn)行了考察。在等度洗脫條件下主峰與相鄰雜質(zhì)分離度不理想，個(gè)別雜質(zhì)出峰較晚；而采用梯度洗脫時(shí)，主成分與各雜質(zhì)均能達(dá)到有效分離，且各峰純度都達(dá)100%。故本試驗(yàn)最終選擇該流動(dòng)相系統(tǒng)和梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫。

3.3 雜質(zhì)A、B、C、D、E的定量

本試驗(yàn)中將雜質(zhì)A、B、C、D、E作為已知雜質(zhì)進(jìn)行研究，雜質(zhì)A、C、D、E的校正因子均不在0.9～1.1范圍內(nèi)。為準(zhǔn)確計(jì)算樣品中雜質(zhì)含量，各已知雜質(zhì)均按外標(biāo)法，以峰面積計(jì)算，未知雜質(zhì)按自身對(duì)照法進(jìn)行定量計(jì)算。