艾鑫，董欣煒

（1.天津威特生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，天津 300301；2.康地飼料添加劑（北京）有限公司，北京 100020）

沙門氏菌是一種重要的人獸共患病病原，廣泛存在于自然界、人和動物腸道，能夠引起人類和多種動物發(fā)病，如人的傷寒、副傷寒，豬副傷寒，禽類的雞白痢、禽傷寒、禽副傷寒，反芻動物腹瀉等。更為重要的是，該菌常常污染動物性食品，隨食物鏈進(jìn)入人體。近年來，隨著抗菌藥物大量使用，多重耐藥沙門氏菌菌株廣泛出現(xiàn)，這更增加了動物源沙門氏菌感染人類發(fā)病之后的治療難度，增加治療成本。

為了解重慶市合川區(qū)豬源耐藥沙門氏菌的流行情況，為養(yǎng)殖企業(yè)的臨床用藥提供指導(dǎo)，本試驗對合川區(qū)部分豬場的沙門氏菌進(jìn)行了分離鑒定，并測定其對26種抗菌藥物的敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 沙門氏菌菌株 CQFL7PS001菌株由本公司實驗室保存。

1.1.2 試劑及藥品 MH培養(yǎng)基、沙門氏志賀氏菌屬增菌培養(yǎng)基、藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司；XLD培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。26種藥敏紙片包括：（1）β-內(nèi)酰胺類：（A）青霉素類：氨芐西林，（B）頭孢菌素類：頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟，（C）碳青霉烯類：亞胺培南，（D）單環(huán)內(nèi)酰胺類：氨曲南；（2）氨基糖苷類：鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星；（3）四環(huán)素類：四環(huán)素、多四環(huán)素；（4）酰胺醇類：氯霉素、氟苯尼考；（5）喹諾酮類：萘啶酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、依諾沙星；（6）磺胺類：復(fù)方新諾明、甲氧嘧啶。

1.1.3 樣品采集 2017年11月至2018年3月于重慶市合川區(qū)的3家規(guī)?；B(yǎng)豬場采集豬糞樣品：用無菌棉簽取1 g左右的糞便于2mL滅菌離心管中。采集的所有樣本均置于有冰袋的泡沫箱中，6h之內(nèi)運回實驗室進(jìn)行處理。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 在每個裝有豬糞便的離心管中加入1mL PBS，振蕩后靜置2h，使細(xì)菌從糞便中游離出來。重懸后吸取200μL PBS于滅菌的沙門氏志賀氏菌屬增菌液中，220r/min 37℃培養(yǎng)6～12h，樣品增菌后，將菌液劃線于XLD瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～28h。

1.2.2 沙門氏菌疑似菌株的形態(tài)學(xué)觀察 從XLD平板劃線區(qū)挑取3個圓形、光滑的單菌落接種于LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48h，再從LB平板上挑取單菌落，革蘭氏染色后觀察細(xì)菌形態(tài)。根據(jù)形態(tài)觀察結(jié)果，將疑似細(xì)菌菌落再次接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃220r/min振蕩培養(yǎng)8h。

1.2.3 沙門氏菌分子生物學(xué)檢測

（1）沙門氏菌特異性基因的引物設(shè)計與合成：根據(jù)GenBank中公布的invA基因全序列，用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物，交由英濰捷基公司合成。引物序列invA-F：5′-GTGAAATTAT CGCCACGTTCGGGCAA-3′，invA-R：5′-TCATCGCAC CGTCAAAGGAACC-3′。

（2）PCR模板的制備：將疑似菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)8 h；取1.5 mL菌液于室溫下13000r/min離心2min，棄上清；加入1 mL滅菌ddH2O重懸，室溫下13000r/min離心2min，棄上清；加入 70 μL ddH2O，105℃處理 10 min，然后置于冰上冷卻，以13 000r/min離心1min，取上清作為PCR反應(yīng)的模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）沙門氏菌的PCR鑒定：PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，invA-F（10 pmol/μL）0.5μL，invA-R（10pmol/μL）0.5μL，模板 DNA 0.5μL，ddH2O 11μL，總反應(yīng)體系25μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 15 s，58℃退火 15 s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；72℃延伸6min。

1.2.4 藥物敏感性試驗 采用KB紙片擴(kuò)散法將保存的菌種劃線接種于LB平板，37℃培養(yǎng)20h左右；挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值為0.11（0.5個麥?zhǔn)媳葷釂挝唬?；用移液槍吸?00μL菌液至Mueller-Hinton平板，用無菌棉簽均勻涂抹，室溫放置3～5min；待培養(yǎng)基表面水分吸干后，用眼科鑷將藥敏紙片貼于平板表面（紙片一旦與平板接觸不應(yīng)再移動），每個紙片中心相距大于24mm，紙片距平板內(nèi)緣大于15mm，于37℃恒溫箱培養(yǎng)15h后，測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑。藥物敏感性結(jié)果根據(jù)《動物源抗菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》和《抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)第二十五版資料增刊》判定。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離情況 通過形態(tài)學(xué)觀察和PCR鑒定，在50份糞便樣品中分離到10株沙門氏菌，分離率為20.0%。分離的10株菌均能特異性地擴(kuò)增出284bp的invA基因片段（圖1）。

圖1 沙門氏菌PCR鑒定結(jié)果

2.2 藥敏試驗結(jié)果 本次在合川區(qū)分離的菌株對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、鏈霉素、氧氟沙星完全敏感；對頭孢西丁、氨曲南的敏感性也較高，僅1株有耐藥性；對四環(huán)素、氟苯尼考完全耐藥；對慶大霉素、多西環(huán)素、氯霉素、環(huán)丙沙星、甲氧嘧啶的耐藥率為90%；對卡那霉素、復(fù)方新諾明的耐藥率為80%；對萘啶酸的耐藥率為70%；對頭孢氨芐的耐藥率為50%；對氨芐西林、頭孢唑啉、頭孢噻肟、亞胺培南、阿米卡星、諾氟沙星、恩諾沙星、依諾沙星的耐藥率在20%～40%（詳見表1）。所有菌株均為多重耐藥菌株，除1株分離菌外，其余菌株均對10種及以上藥物耐藥，特別是菌株1、2、3、5，耐藥數(shù)量超過50%。

表1 10株沙門氏菌對不同抗菌藥物的敏感性

3 討論

沙門氏菌是一類在世界范圍內(nèi)廣泛存在的食源性細(xì)菌[1]，我國22.2%的食源性疾病由沙門氏菌引起，是第四大食源性疾病[2]。沙門氏菌血清型眾多，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過2600種血清型[3]。根據(jù)宿主感染范圍，沙門氏菌分為宿主適應(yīng)性血清型和非宿主適應(yīng)性血清型。非宿主適應(yīng)性血清型指能感染多種動物和人的血清型，如鼠傷寒沙門氏菌、德爾俾沙門氏菌、都柏林沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等。

近30年來，抗菌藥物在動物養(yǎng)殖上的廣泛應(yīng)用使得耐藥菌株迅速增加，有研究者報道，食品動物中抗菌藥物的濫用和病原菌耐藥之間存在密切聯(lián)系[4]。沙門氏菌多重耐藥菌株的出現(xiàn)，已經(jīng)嚴(yán)重影響到公共衛(wèi)生安全。因此，對動物和動物源性食品中沙門氏菌耐藥性的監(jiān)測，對于保證食品安全和貿(mào)易都十分重要[5-6]。

藥物敏感性試驗表明，所有分離菌株均為多重耐藥株，說明合川區(qū)養(yǎng)豬場使用抗菌藥物極其普遍和不規(guī)范。還存在對人用抗菌藥物的耐藥現(xiàn)象，如對碳青霉烯類抗生素——亞胺培南和單環(huán)內(nèi)酰胺類抗生素——氨曲南均有耐藥性。從表1可見，10株臨床分離菌對亞胺培南和氨曲南分別有20%和10%的耐藥率。亞胺培南和氨曲南是人專用抗生素，在動物源性沙門氏菌中出現(xiàn)耐藥菌株，可能與其他耐藥質(zhì)粒同時攜帶耐碳青霉烯類和單環(huán)內(nèi)酰胺類藥物基因有關(guān)[7]。