馬志良

(藏藥研發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省藏醫(yī)藥研究院，西寧 810016)

康定鼠尾草(SalviaprattiiHemsl.)屬唇形科(Labiatae)鼠尾草屬(SalviaLinn.) 植物，產(chǎn)于四川西部和西北部、青海省南部等地區(qū)，早在幾千年前該屬種植物就成為重要的藥用植物。唇形科鼠尾草屬植物全世界有1 000種。我國有83種，青海有3種，大多數(shù)以根入藥作丹參用[1]。其中青海省的3種分別為甘西鼠尾草、黏毛鼠尾草和康定鼠尾草[2]。鼠尾草主要含萜類、酚酸類和黃酮類等成分[3]。丹參是該屬植物的代表藥材，具有活血祛瘀、調(diào)經(jīng)止痛和清熱安神等功效[4]。研究表明，黃酮類化合物具有抗肝臟毒性、抗炎、抗免疫、抗肝纖維化、抗菌、抗病毒和解痙攣等作用[5-14]。本實(shí)驗(yàn)以康定鼠尾草莖葉為原料，對總黃酮進(jìn)行超聲提取[15]，提取過程研究了乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比等對總黃酮得率的影響，在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法對主要因素進(jìn)行優(yōu)化，為大批量生產(chǎn)提供科學(xué)的參考依據(jù)[16-17]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 CRAY300紫外分光光度計(jì)(美國瓦里安公司)；KQ-100E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器科技有限公司)；MOLELEMENT元素型超純水機(jī)(上海摩勒生物科技有限公司)。

1.2試藥 康定鼠尾草采自青海省玉樹藏族自治州，經(jīng)青海省藏醫(yī)藥研究院多杰研究員鑒定為唇形科植物康定鼠尾草(SalviaprattiiHemsl.)。蘆丁(批號(hào)100080-201610)對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，無水乙醇等均為國產(chǎn)市售分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1蘆丁最大吸收波長掃描和標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確稱取烘干至恒質(zhì)量的蘆丁對照品10 mg，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶解，搖勻，定容至100 mL量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

取適量上述蘆丁對照品溶液，采用紫外分光光度法在400～600 nm掃描，確定最大吸收波長。

分別精密量取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL的上述蘆丁對照品溶液，分別置于50 mL 量瓶中，滴加質(zhì)量濃度為50 g·L-1的NaNO2溶液1 mL，再加入質(zhì)量濃度為100 g·L-1的Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，反應(yīng)6 min后加質(zhì)量濃度為400 g·L-1的NaOH 1 mL。用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇稀釋至刻度，顯色15 min，以空白對照作為參比，在最大吸收波長510 nm處測定吸光度值A(chǔ)。以吸光度值A(chǔ)和質(zhì)量濃度C進(jìn)行線性回歸，并繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2總黃酮的含量測定 精密稱定康定鼠尾草粉末0.5 g，加入一定量的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，置于量瓶中，超聲提取2次，合并2次濾液，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇稀釋至刻度。按照2.1項(xiàng)下方法測定總黃酮的含量。

2.3方法學(xué)考察 按照2.2項(xiàng)下含量測定方法進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，采用Al(NO3)3-NaNO2法[18]分別進(jìn)行精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率實(shí)驗(yàn)，對康定鼠尾草總黃酮進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.4單因素實(shí)驗(yàn) 按照2.2項(xiàng)下提取方法，先通過單因素實(shí)驗(yàn)選出對康定鼠尾草中總黃酮提取率具有顯著影響的因素，確定其實(shí)驗(yàn)水平。分別考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對康定鼠尾草中總黃酮提取率的影響。

2.5響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)3個(gè)提取影響較顯著的因素，根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，采用經(jīng)典的3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)表，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，確定康定鼠尾草中總黃酮提取的最佳工藝[19-20]，實(shí)驗(yàn)因素和水平見表1。

表1Box-Behnken因素與水平

Tab.1 Factors and levels in Box-Behnken design

因素水平-101X1,超聲時(shí)間/min304050X2,液料比8∶110∶112∶1X3,乙醇體積分?jǐn)?shù)/%607080

3 結(jié)果

3.1蘆丁對照品的最大吸收波長和標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用CRAY300紫外分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，蘆丁的最大吸收波長為510 nm。故在510 nm波長處測得蘆丁的線性回歸方程為：y=0.245 9x+0.035 9(r=0.999 8)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

3.2方法學(xué)考察

3.2.1精密度實(shí)驗(yàn) 稱取6份康定鼠尾草樣品，每份0.2 g，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，取6份濾液，分別測定吸光度值，計(jì)算RSD值為1.31%(n=6)，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.2.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取6份康定鼠尾草樣品，每份0.2 g，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，分別測定吸光度值，計(jì)算總黃酮的平均含量為7.97%，RSD值為1.53%(n=6)，結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

3.2.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照樣品測定方法操作，測定同一供試品溶液在不同時(shí)間的吸光度值。結(jié)果表明，顯色后30 min內(nèi)吸光度值較穩(wěn)定，隨著時(shí)間的延長，樣品吸光度值逐漸下降，故應(yīng)在顯色后30 min內(nèi)進(jìn)行測定。

3.2.4回收率實(shí)驗(yàn) 稱取6份康定鼠尾草樣品，每份0.1 g，按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，分別加入蘆丁對照品2.0 mg，制備供試品溶液，分別測定吸光度值，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2總黃酮回收率

Tab.2 Recovery rates of flavonoids

(n=6)

3.3單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1提取時(shí)間對總黃酮得率的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、液料比為10∶1條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，考察提取時(shí)間與總黃酮得率之間的關(guān)系。根據(jù)Fick擴(kuò)散定律確定在提取40 min 內(nèi)總黃酮提取率呈上升趨勢；達(dá)到一定的時(shí)間后會(huì)使擴(kuò)散次數(shù)降低，總黃酮得率也隨之降低，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定提取時(shí)間為40 min。

3.3.2液料比對總黃酮得率的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲時(shí)間為40 min的條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，考察液料比和總黃酮得率之間的關(guān)系。液料比在一定范圍內(nèi)，總黃酮得率隨著液料比的增加而升高，當(dāng)達(dá)到一定程度后，液料比對總黃酮得率無影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定液料比為10∶1。

3.3.3乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率的影響 在提取1次、超聲50 min、液料比為10∶1的條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)和總黃酮得率之間的關(guān)系。在乙醇體積分?jǐn)?shù)小于70%時(shí)，總黃酮得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過70%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，總黃酮得率開始降低。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

3.3.4提取次數(shù)對總黃酮得率的影響 在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲40 min、液料比10∶1的條件下進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，考察提取次數(shù)和總黃酮得率之間的關(guān)系。當(dāng)提取2次時(shí)，總黃酮得率呈上升趨勢，提取2次后總黃酮得率變化不大。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定提取次數(shù)為2次。

3.4響應(yīng)面法分析康定鼠尾草總黃酮提取工藝

3.4.1響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值 從單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對康定鼠尾草中總黃酮得率影響較顯著，因此選取這3個(gè)因素作為影響因子，以總黃酮得率為響應(yīng)值，Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

經(jīng)回歸擬合后，得到以康定鼠尾草總黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程：總黃酮含量=-21.073+0.319X1+0.312X2+0.405X3-0.000 34X1X2+0.001 6X1X3-0.000 14X2X3-0.005X12-0.003X22-0.003 1X32。

由表4可知，提取時(shí)間與液料比的“Prob>F”值小于0.05，表明其具有明顯的影響；乙醇體積分?jǐn)?shù)的“Prob>F”值大于0.05，表明其對總黃酮得率影響不顯著；整體模型的“Prob>F”值小于0.01，表明其具有明顯的影響；失擬項(xiàng)比F為7.60，表明其無影響；決定系數(shù)為0.954 2，表明其變量之間有顯著關(guān)系，該回歸方程可用于總黃酮得率的預(yù)測。

表3Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

Tab.3 Box-Behnken design proposal

編號(hào)超聲時(shí)間/min液料比乙醇體積分?jǐn)?shù)/%總黃酮得率/%14012∶1805.71124010∶1706.29434010∶1706.1324408∶1805.50155010∶1805.70163012∶1705.57174010∶1706.14684012∶1605.61495010∶1605.518104010∶1706.309113010∶1804.930125012∶1705.47413508∶1705.234143010∶1605.37415408∶1605.347164010∶1706.20217308∶1705.194

3.4.2響應(yīng)面回歸模型的方差分析 見表4。

表4回歸方程方差分析

Tab.4 Analysis of variance of regression equation

參數(shù)自由度DF平方和SS均方MSFP(Prob>F)X110.0080.002 80.330.049 4X210.0010.002 10.250.046 7X310.000 970.000 970.120.983 0X1X210.000 000 40.000 000 40.000 0590.994 1X1X310.000 680.000 680.810.396 8X2X310.000 360.000 360.0420.842 5X1210.0580.0586.950.033 6X2210.0180.0182.210.180 9X3210.0250.0252.960.129 2模型90.1300.0148.660.002 2失誤項(xiàng)30.0140.0147.600.039 6誤差項(xiàng)40.0180.004 4總和160.180

3.4.3響應(yīng)曲面結(jié)果分析 各因素對響應(yīng)值的影響見圖1。其中液料比的影響最為明顯，最佳值為10∶1；另外，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、超聲時(shí)間為40 min時(shí)最佳。

圖1各提取因素之間的交互作用影響

Fig.1 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of polysaccharides

3.4.4總黃酮提取工藝條件的確定 根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究選擇最佳提取工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比和超聲時(shí)間分別為70.19%、10.94∶1和41.03 min，總黃酮得率可達(dá)6.24%。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)研究選擇康定鼠尾草為原料，先通過Al(NO3)3-NaNO2法對康定鼠尾草中的總黃酮進(jìn)行了方法學(xué)考察。其中精密度實(shí)驗(yàn)RSD值為1.31%，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD值為1.53%，在顯色后30 min內(nèi)較穩(wěn)定，平均回收率為101.98%，RSD值為1.94%，結(jié)果表明，本方法精密度較高，重復(fù)性較好。

研究通過單因素實(shí)驗(yàn)選擇了合適的提取工藝參數(shù)，并在此基礎(chǔ)上開展了總黃酮的最佳超聲提取工藝研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，超聲時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮得率有明顯的影響，最佳參數(shù)為超聲時(shí)間40 min、液料比10∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，且該方法能夠有效提高總黃酮得率，實(shí)驗(yàn)所采取的提取方法可用于更多方面的探索性研究，為鼠尾草的綜合利用提供依據(jù)。