由高銘，陳欣然，趙前程，馬永生，李 萌，馬 壯

( 1.大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.新疆賽湖漁業(yè)科技開發(fā)有限公司，新疆 博樂 833400 )

新疆賽里木湖養(yǎng)殖的高白鮭(Coregonuspeled)富含營養(yǎng)成分，具有較高的食用價值和經(jīng)濟價值，目前以冰鮮產(chǎn)品為主運輸至北京、上海等消費地域[1]。細菌的繁殖代謝是導(dǎo)致魚肉等水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的重要因素，但只有少數(shù)細菌能適應(yīng)貯藏環(huán)境快速繁殖成為優(yōu)勢腐敗菌，主導(dǎo)腐敗過程[2-3]?？蓪⑺a(chǎn)品浸泡于山梨酸鉀、乳酸鏈球菌素、茶多酚或ε-聚賴氨酸等溶液，使抑菌劑吸附至水產(chǎn)品表面后，再加以冷藏達到抑菌防腐的目的[4-7]。分析不同抑菌劑對冷藏魚肉中微生物的影響，可利用非線性模型如修正Gompertz方程和Baranyi & Robertz方程，它們是常見的預(yù)測食品貨架期的微生物動力學(xué)生長模型，其各項擬合生長參數(shù)如延滯期和最大比生長速率等因子可指示抑菌效果[7]。目前，常見化學(xué)抑菌劑山梨酸鉀和生物抑菌劑ε-聚賴氨酸鹽在冷藏魚肉基質(zhì)中抑菌性能的研究較少，同時缺少不同浸泡技術(shù)對其抑菌性能影響的研究。因此，筆者對冷藏高白鮭魚肉的腐敗菌進行分離鑒定，后續(xù)采用山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽浸泡液經(jīng)真空浸泡和常壓浸泡對高白鮭魚肉進行抑菌處理，利用非線性模型擬合生長參數(shù)，分析山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽浸泡液對魚肉基質(zhì)中腐敗菌的抑菌活性，為后期冷藏魚肉防腐抑菌劑的開發(fā)和利用奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

高白鮭由新疆賽湖漁業(yè)科技開發(fā)有限公司提供。

營養(yǎng)瓊脂、假單胞菌CFC選擇培養(yǎng)基基礎(chǔ)、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂、CFC添加劑(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)；鐵瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司)；即用PCR擴增試劑盒(Taq)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；三氯乙酸(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；山梨酸鉀(寧波王龍科技股份有限公司)；ε-聚賴氨酸鹽(浙江新銀象生物工程有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

真空干燥機(上海森信實驗儀器有限公司)；拍打式無菌均質(zhì)機(寧波新芝生物科技有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海森信實驗儀器有限公司)；全自動凱氏定氮儀(意大利VELP公司)；潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

鮮活高白鮭(每條約600 g/尾)從新疆賽里木湖捕撈后立即宰殺，去頭、去內(nèi)臟、去皮洗凈后沿魚背脊將魚肉平均分為兩片，分裝至無菌包裝袋與碎冰1∶1的比例放置于泡沫箱內(nèi)，冷鏈空運至大連。在無菌超凈臺內(nèi)，將魚肉進行分割處理，在無菌水浸泡清洗，取出瀝干，置于無菌袋中密封，4 ℃保存。

1.3.2 冷藏高白鮭腐敗菌的分離和純化

高白鮭魚肉在4 ℃保藏至第8 d時色澤發(fā)黃，肉質(zhì)無彈性、發(fā)黏，汁液流失嚴重，有明顯臭味，感官判斷為腐敗末期，此時無菌取樣10 g，加入90 mL無菌生理鹽水，均質(zhì)后，用無菌生理鹽水進行10倍稀釋，選取合適稀釋梯度，取100 μL稀釋液在營養(yǎng)瓊脂平板上涂布。平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，30 ℃培養(yǎng)72 h。將平板中細菌重復(fù)至少3次平板劃線，得到純化后的腐敗菌單菌落。

1.3.2 腐敗菌分子生物學(xué)鑒定

采用沸水浴法提取細菌DNA，構(gòu)建PCR擴增體系，利用如下PCR擴增條件進行擴增：94 ℃變性5 min，進行35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s)，72 ℃延伸 10 min。取9 μL PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，若PCR擴增條帶單一明亮，則將PCR擴增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序工作；16S rDNA序列利用美國國立生物技術(shù)信息中心中的Blast進行序列比對。

1.3.3 魚肉基質(zhì)的抑菌試驗

0.5%的山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽溶液分別經(jīng)0.45 μm無菌濾器過膜除菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩⑿迈r魚肉置于無菌燒杯內(nèi)，按照魚肉和抑菌劑1∶2(m/V)的比例加入山梨酸鉀或ε-聚賴氨酸鹽溶液，分別進行真空和常壓浸泡處理，得到真空浸泡山梨酸鉀魚肉樣品，真空浸泡ε-聚賴氨酸鹽魚肉樣品，常壓浸泡山梨酸鉀魚肉樣品和常壓浸泡ε-聚賴氨酸鹽魚肉樣品。以無菌水浸泡液為空白對照組，在相同條件下浸泡魚肉，獲得真空浸泡空白對照組和常壓浸泡空白對照組。其中，真空浸泡包括兩個步驟，在真空度0.08 MPa環(huán)境中浸泡處理15 min；恢復(fù)至常壓條件，再浸泡15 min。

浸泡完成后，在超凈臺內(nèi)將魚肉取出放置無菌托盤內(nèi)，無菌紗布吸干水分，將魚肉分裝到無菌袋內(nèi)，每袋約10 g，密封后4 ℃避光保存。在第0、2、4、6、8 d時測定魚肉的微生物指標變化。

1.3.4 細菌總數(shù)和腐敗菌測定

根據(jù)國標GB/T 4789.2—2010[8]測定：稱取10 g魚肉置盛有90 mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min，制成1∶10的樣品勻液。用無菌鹽水進行10倍梯度稀釋，吸取100 μL不同稀釋度的樣品溶液，分別均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基、鐵瓊脂、CFC選擇性培養(yǎng)基平板內(nèi)，培養(yǎng)48 h，測定菌落總數(shù)、腸桿菌、產(chǎn)硫菌和假單胞菌數(shù)目。

1.3.5 微生物擬合生長參數(shù)的測定

修正Gompertz模型應(yīng)用Origin軟件中的Nonlinar Curve Fit功能進行擬合，其中修正Gompertz方程為：

Nt=N0+(Nmax-N0)×exp{-exp[2.718μmax/(Nmax-N0)(Lag-t)+1]}

(1)

式中，Nmax、N0為最大和初始細菌數(shù)量對數(shù)值，Lag為延滯期，μmax為最大比生長速率[9]。

Baranyi & Robertz模型利用Combase在線軟件中DMFit功能進行擬合，軟件依據(jù)的方程為：

(2)

Y1=μmaxt+ ln[e-μmaxt-e-μmax(t+tlag)+e-μmaxtlag]

(3)

Y2= ln[1+10(Y0-Ymax)(e-μmax(t-λ)-e-μmaxtlag]

(4)

式中，Y0為細菌初始數(shù)量對數(shù)值，Ymax為細菌達到穩(wěn)定期時數(shù)量的對數(shù)值，Lag為延滯期和μmax為最大比生長速率[10]。

采用殘差標準誤差和決定系數(shù)評價模型的擬合能力。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)取3次平行試驗結(jié)果，以平均值±標準差表示。利用SPSS 19.0軟件進行相關(guān)性、單因素方差分析和獨立樣本t檢驗等分析，其中P<0.05為顯著性差異。采用OriginPro 8.5軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 冷藏高白鮭腐敗菌的分離鑒定

冷藏高白鮭魚肉貯藏末期，根據(jù)肉眼觀察菌落形態(tài)、菌落顏色、隆起狀態(tài)、邊緣和表面狀態(tài)，篩選出存在差異的27株菌落，16S rDNA測序比對分析的結(jié)果見表1。冷藏高白鮭魚肉貯藏末期的27株腐敗菌中包含9株沙雷氏菌屬(Serratia)細菌，5株拉恩氏菌屬(Rahnella)細菌，3株哈夫尼菌屬(Hafnia)細菌，2株克雷伯菌屬(Klebsiella)細菌，即分離篩選的腐敗菌中70%屬于腸桿菌科；另外，鑒定出4株細菌為弧菌科希瓦氏菌屬(Shewanella)的腐敗希瓦氏菌(S.putrefaciens)，占總比例的16%；其余為芽孢桿菌屬(Bacillus)和肉食桿菌屬(Carnobacterium)細菌。

表1 冷藏高白鮭魚腐敗菌16S rDNA 鑒定結(jié)果

2.2 冷藏高白鮭魚肉中菌落總數(shù)的動態(tài)變化

真空浸泡對照組和常壓浸泡對照組中魚肉的初始菌落數(shù)對數(shù)分別為4.34 log(cfu/g)和4.44 log(cfu/g)，隨時間的延長，魚肉中菌落總數(shù)對數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢(圖1)。利用修正Gompertz方程和Baranyi & Robertz方程擬合冷藏魚肉中細菌的生長參數(shù)，結(jié)果見表2。

兩種模型擬合的真空浸泡對照組和常壓浸泡對照組生長參數(shù)如細菌總數(shù)初始密度對數(shù)，最高密度對數(shù)以及細菌生長延滯期均無差異，說明真空浸泡處理方式對魚肉的細菌總數(shù)增長無影響。山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽浸泡液能有效延長魚肉中細菌的延滯期，并降低細菌達到穩(wěn)定期時的最高密度，表明山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽能夠有效延緩冷藏高白鮭魚細菌總數(shù)的增長。然而，真空浸泡試驗組魚肉與常壓浸泡試驗組魚肉在各項生長參數(shù)上并無明顯優(yōu)勢。

2.3 冷藏高白鮭魚肉中腸桿菌的動態(tài)變化

利用修正Gompertz方程和Baranyi & Robertz方程擬合冷藏高白鮭魚肉中腸桿菌動態(tài)變化，各項擬合生長參數(shù)見表3。

對照組魚肉樣品中腸桿菌的初始菌落數(shù)目對數(shù)均低于2 log(cfu/g)，表明產(chǎn)品加工過程中衛(wèi)生條件控制較好。依據(jù)擬合效果更好的修正Gompertz模型，經(jīng)山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽浸泡處理的魚肉中腸桿菌初始菌落數(shù)對數(shù)均低于對照組，延滯期延長，然而細菌最大比生長速率提高，表明山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽浸泡液在貯藏初期能有效抑制魚肉中腸桿菌的活性，但在后期抑制效果較差。真空浸泡與常壓浸泡試驗組腸桿菌的各項生長參數(shù)之間并無顯著差異，表明真空浸泡方式未能提高抑菌劑的抑菌活性。

表2 冷藏高白鮭魚肉細菌總數(shù)動力學(xué)生長模型的各項參數(shù)

注：Lag為延滯期，μmax為最大比生長速率，RSE為殘差標準誤差，r2為決定系數(shù)，Y0為細菌初始數(shù)量對數(shù)值，Ymax為細菌達到穩(wěn)定期的數(shù)量對數(shù)值.下同.

表3 冷藏高白鮭魚肉腸桿菌動力學(xué)生長模型的各項擬合參數(shù)

圖1 冷藏高白鮭魚肉菌落總數(shù)變化情況 a.真空浸泡處理， b.常壓浸泡處理. VP.真空浸泡， AP.常壓浸泡， C.空白對照， PS.山梨酸鉀， PLH.ε-聚賴氨酸鹽.

2.4 冷藏高白鮭魚肉中產(chǎn)硫菌的動態(tài)變化

山梨酸鉀浸泡液能有效抑制魚肉中產(chǎn)硫菌的生長繁殖，在魚肉貯藏過程中，產(chǎn)硫菌數(shù)目均低于2 log(cfu/g)。對于空白組和ε-聚賴氨酸鹽試驗組中產(chǎn)硫菌的生長變化，修正Gompertz方程比Baranyi & Robertz方程的殘差標準誤差值低，決定系數(shù)值高，整體擬合效果更好(表4)。依據(jù)修正Gompertz模型擬合結(jié)果，ε-聚賴氨酸鹽試驗組魚肉中產(chǎn)硫菌的延滯期比對照組延長，但最大比生長速率未降低，說明在貯藏初期ε-聚賴氨酸鹽對貯藏魚肉基質(zhì)中產(chǎn)硫菌的活性有抑制作用。然而，真空浸泡和常壓浸泡試驗組魚肉之間的產(chǎn)硫菌各項生長參數(shù)均無顯著性變化，表明浸泡方式對抑菌劑抑制產(chǎn)硫菌的效果無影響。

2.5 冷藏高白鮭魚肉中假單胞菌的動態(tài)變化

修正Gompertz方程比Baranyi & Robertz方程的殘差標準誤差值低，決定系數(shù)值高，說明前者能更好的擬合魚肉中假單胞菌的生長變化(表5)。依據(jù)修正Gompertz模型擬合結(jié)果，常壓浸泡空白組魚肉中假單胞菌最大比生長速率為(0.55±0.19)/d，真空浸泡對照組為(1.26±0.03)/d，表明真空浸泡導(dǎo)致魚肉中假單胞菌的生長速率增大。同時，真空浸泡試驗組中假單胞菌的延滯期或最大比生長速率要差于常壓浸泡組，表明真空浸泡未提高ε-聚賴氨酸鹽和山梨酸鉀對魚肉基質(zhì)中假單胞菌的抑制能力。常壓浸泡狀態(tài)下，山梨酸鉀試驗組魚肉中的假單胞菌生長速率和最高細菌密度對數(shù)均低于對照組，ε-聚賴氨酸鹽試驗組的延滯期要長于對照組，說明山梨酸鉀對魚肉基質(zhì)中的假單胞菌有抑制效果，而ε-聚賴氨酸鹽僅在貯藏初期有抑菌效果。

表4 冷藏高白鮭魚肉產(chǎn)硫菌動力學(xué)生長模型的各項擬合參數(shù)

表5 冷藏高白鮭魚肉假單胞菌動力學(xué)生長模型的各項擬合參數(shù)

3 討 論

3.1 冷藏高白鮭魚肉的腐敗菌

引起水產(chǎn)品腐敗的主要原因是外源性腐敗菌的繁殖，而在不同的貯藏條件下，導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的腐敗菌種類不同[11]。Sade等[12]的研究表明，氣調(diào)包裝的肉制品中，腸桿菌占總細菌的60%，其中沙雷氏菌屬如泉居沙雷氏菌(S.fonticola)、格氏沙雷氏菌、液化沙雷氏菌和變形斑沙雷氏菌等占腸桿菌的42%，哈夫尼菌屬占40%。沙雷氏菌屬也是真空包裝和氣調(diào)包裝的大西洋鮭(Salmosalar)魚肉中的優(yōu)勢腐敗菌[13]。產(chǎn)硫菌，尤其是腐敗希瓦氏菌，為淡水魚低溫冷藏過程中的優(yōu)勢腐敗菌[14]。與上述研究結(jié)果一致，本研究中分離獲得的腐敗菌中腸桿菌占總細菌的70%，產(chǎn)硫菌腐敗希瓦氏菌占16%，可能是導(dǎo)致冷藏高白鮭魚片產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要腐敗菌。

有氧冷藏條件下，假單胞菌屬為生鮮水產(chǎn)品中常見的腐敗菌，產(chǎn)生大量醛、酮、酯和有異味的揮發(fā)性產(chǎn)物[15]。采用傳統(tǒng)檢測腐敗菌方法未檢出假單胞菌，主要是因為基于培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測腐敗菌方法具有一定的局限性[16-18]。為更有效的分析腐敗菌的變化情況，在后續(xù)的試驗中，筆者將對冷藏高白鮭魚肉中的腸桿菌、產(chǎn)硫菌和假單胞菌均進行選擇性培養(yǎng)，探究抑菌劑對主要腐敗菌的抑制情況。

3.2 非線性模型擬合微生物生長變化

殘差標準誤差值越小，決定系數(shù)值越高，模型擬合效果越好，表2中各組細菌的擬合模型殘差標準誤差值均低于0.38，且決定系數(shù)均在0.97以上，表明修正Gompertz方程和Baranyi & Robertz方程均能較好地反映出各組冷藏魚肉中細菌總數(shù)的生長情況。由表3～表5中殘差標準誤差值和決定系數(shù)值可知，修正Gompertz方程較Baranyi & Robertz方程的整體擬合效果更好，能夠更準確的描述魚肉中腐敗菌的生長動態(tài)。而丁婷等[19]的研究表明，Baranyi & Robertz方程來描述冷藏三文魚片中腐敗菌的生長動態(tài)比修正Gompertz方程更適合。這可能是由不同的魚肉基質(zhì)導(dǎo)致腐敗菌生長狀態(tài)具有差異性所致。

3.3 抑菌劑對魚肉基質(zhì)中腐敗菌的抑制效果

經(jīng)山梨酸鉀或ε-聚賴氨酸鹽浸泡處理后，冷藏高白鮭魚肉的細菌總數(shù)均低于對照組魚肉，與利用山梨酸鉀或ε-聚賴氨酸浸泡液有效降低冷藏扁裸頰鯛(Lethrinuslentjan)[20]、冷藏花鱸(Lateolabraxjaponicus)[6]魚肉中的細菌總數(shù)的研究結(jié)果一致。

周婷等[21-22]研究表明，0.5‰的山梨酸鉀能有效抑制水產(chǎn)品中腐敗菌的繁殖。在本研究中，0.5%的山梨酸鉀浸泡液能有效抑制冷藏高白鮭魚肉中希瓦氏菌和假單胞菌的繁殖，然而，魚肉中腸桿菌的最大比生長速率高于對照組。Gen?celep等[23]的研究也發(fā)現(xiàn)，山梨酸鉀浸泡液對冷藏珍珠鯔魚(Chalcalburnustarichi)中腸桿菌的抑菌能力與浸泡液含量密切相關(guān)，5%山梨酸鉀浸泡液能有效抑制腸桿菌的繁殖，但1%含量的抑菌劑在貯藏后期無顯著抑菌效果。

經(jīng)0.5%的ε-聚賴氨酸鹽浸泡液處理后，冷藏高白鮭魚肉中的腸桿菌、產(chǎn)硫菌和假單胞菌最大比生長速率均高于對照組。這可能是魚肉基質(zhì)中ε-聚賴氨酸鹽含量較低的緣故。張全景等[24]發(fā)現(xiàn)ε-聚賴氨酸在低質(zhì)量濃度條件下可能具有殺滅和抑制共同存在的致傷作用，并不能完全殺滅細菌。貯藏末期，受傷害程度不同的微生物經(jīng)過不同時間的修復(fù)能夠重新繁殖。

3.4 浸泡方式對抑菌劑抑菌效果的影響

抑菌物質(zhì)在水產(chǎn)品特別是魚肉表面的擴散易受到食品基質(zhì)的影響，導(dǎo)致抑菌活性減弱，通過增強抑菌物質(zhì)的擴散性，可提高其在食品基質(zhì)中的抑菌性能。與傳統(tǒng)的常壓浸泡技術(shù)相比，真空浸泡可將溶液快速均勻的滲透到食品內(nèi)部并且可減少食品中水分和營養(yǎng)物質(zhì)的流失[25]。Andrés-Bello等[26]發(fā)現(xiàn)，真空浸泡能有效提高乳酸菌和乳酸鏈球菌素在冷藏金頭鯛(Sparusaurata)魚肉中的抑菌活性，有效抑制菌落總數(shù)和腸桿菌的繁殖；但在本試驗中，真空浸泡并未有效提高山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽在魚肉基質(zhì)中對菌落總數(shù)、腸桿菌和產(chǎn)硫菌的抑制效果，反而加速了假單胞菌的繁殖。這可能與抑菌劑的種類以及魚肉本身的組織結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。

3.5 小結(jié)

冷藏高白鮭魚肉貯藏末期的腐敗菌主要由腸桿菌科的沙雷氏菌屬以及產(chǎn)硫菌(腐敗希瓦氏菌)構(gòu)成。修正Gompertz方程對冷藏高白鮭魚肉中腐敗菌繁殖變化的擬合效果優(yōu)于Baranyi & Robertz方程，且通過擬合生長參數(shù)得知山梨酸鉀和ε-聚賴氨酸鹽能有效抑制冷藏高白鮭基質(zhì)中細菌總數(shù)和腐敗菌的生長繁殖，但真空浸泡不能促進抑菌劑對魚肉中腐敗菌的抑菌活性，反而導(dǎo)致假單胞菌的快速繁殖。后續(xù)可采用非線性模型分析不同含量抑菌劑浸泡或噴淋處理冷藏高白鮭魚肉的抑菌效果，篩選符合國家標準要求的防腐劑和適宜含量，為延長冷藏高白鮭魚肉的貨架期，提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性奠定理論基礎(chǔ)。