陳 濤

(1.陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062； 2.桂林理工大學(xué) 教務(wù)處，廣西 桂林 541004)

三代蟲科屬扁形動(dòng)物門、單殖吸蟲綱、多鉤亞綱、三代蟲目[1]，是一類常見(jiàn)的魚類體外寄生蟲，主要寄生在200種硬骨魚[2]及少數(shù)軟體類和兩棲類的體表[3-4]。全世界記錄的三代蟲已超過(guò)450種，潛在總物種數(shù)可能超過(guò)20 000種[5-8]。三代蟲科國(guó)內(nèi)記錄了3屬60種[9-12]，其中三代蟲屬(Gyrodactylus)共58種、薄片吸蟲屬(Laminiscus)和擬三代蟲屬(Paragyrodactylus)各1種。三代蟲的繁殖方式為獨(dú)特的超胎生，即母體中已孕育子代，子代中又孕育第三代，甚至第四代，而其他單殖吸蟲為卵生[13-14]。三代蟲主要通過(guò)宿主間相互接觸傳播，短期內(nèi)快速增殖，給宿主造成極大危害[15]。隨著魚類養(yǎng)殖密度不斷增大，三代蟲引起的疾病越來(lái)越嚴(yán)重，如G.salaris對(duì)挪威大西洋鮭(Salmosalar)的養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[16]，國(guó)內(nèi)三代蟲病的主要病原體是細(xì)鱗魚三代蟲(G.lenoki)、古雪夫三代蟲(G.gussvi)和小林三代蟲(G.kobayashii)等[17-19]。為了準(zhǔn)確鑒定物種和防控三代蟲病，已開(kāi)展了形態(tài)、分類、繁殖、宿主免疫、種群動(dòng)態(tài)、線粒體基因組、系統(tǒng)進(jìn)化及譜系地理等研究[6,20-22]。目前，三代蟲分類主要通過(guò)測(cè)量后吸器中央大鉤、邊緣小鉤和聯(lián)結(jié)片等骨化結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征，并結(jié)合分子標(biāo)記鑒定[8,23]。筆者綜述了三代蟲的生物學(xué)特征、形態(tài)分類、分子標(biāo)記及線粒體基因組等方面的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)，為生物學(xué)和分類學(xué)研究及病害防治提供基礎(chǔ)資料。

1 三代蟲的生物學(xué)特征

三代蟲雌雄同體，體長(zhǎng)約0.6 mm。蟲體前端有一對(duì)頭器和刺狀感受器，無(wú)眼點(diǎn)；口位于頭器下方中央；咽后為食道及交配囊；體中部?jī)蓚?cè)腸分支；體中后部為生殖系統(tǒng)，包括卵巢、睪丸和卵黃腺等；體后端的后吸器由一對(duì)中央大鉤、背腹聯(lián)結(jié)片各1片及8對(duì)邊緣小鉤組成。

三代蟲通過(guò)后吸器的中央大鉤和邊緣小鉤附著，以寄主的黏液和分泌物為食，頭器的運(yùn)動(dòng)造成寄主損傷，進(jìn)一步引起繼發(fā)感染，導(dǎo)致鰓、鰭潰爛及其他疾病。如大西洋鮭致命性病原體G.salaris對(duì)挪威的養(yǎng)殖和野生鮭魚種群造成極大危害，已被列為口岸檢驗(yàn)物種[24]。G.salaris和G.turnbulli在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)研究超過(guò)5年和10年，受到極大關(guān)注，被稱為寄生蟲界的“果蠅”[25-26]。國(guó)內(nèi)各養(yǎng)殖區(qū)均發(fā)現(xiàn)作為病原體的三代蟲，湖北和廣東尤為嚴(yán)重[27]。

1.1 三代蟲研究歷史

1832年，von Nordmann首次發(fā)現(xiàn)寄生于歐鳊(Abramisbrama)的三代蟲G.wangnei，誤將子宮中胚胎的大鉤理解為“胃鉤”[28]，隨后von Sieboldt第一次證實(shí)三代蟲為胎生繁殖[29]。

有關(guān)三代蟲早期的研究主要集中在染色體和胚胎細(xì)胞等方面[6]；后期逐漸成為魚類病原體而受到關(guān)注[30-31]，其中G.salaris不同程度地感染了挪威37條河流中的大西洋鮭[32]。1970年，Malmberg記錄的三代蟲超過(guò)200種，主要分布于歐洲、亞洲和北美洲[33]，目前已記錄的三代蟲超過(guò)450種[5-9]。

1948年，我國(guó)首次在鯽魚(Carassiusauratus)的體表發(fā)現(xiàn)了秀麗三代蟲(G.elegans)[1]，開(kāi)啟了三代蟲研究，之后陸續(xù)有學(xué)者進(jìn)行三代蟲分類研究，2012年賀懷亞等[10]整理三代蟲物種名錄，共52種，目前共記錄60種[9-12]。

1.2 三代蟲的性早熟和胎生

性早熟是三代蟲的一種生殖適應(yīng)，其中胎生三代蟲高度性早熟[34]，三代蟲屬第一代出生僅需幾天，而卵生的O?egyrodactylusfarlowellae第一代出生則需幾周。Cable等[14]描述三代蟲雌性生殖系統(tǒng)早熟時(shí)，發(fā)現(xiàn)其他單殖吸蟲包括卵生三代蟲的雌性生殖系統(tǒng)包含大量的卵黃腺，而胎生三代蟲僅存在一個(gè)簡(jiǎn)單的細(xì)胞體。胎生三代蟲的雌性生殖系統(tǒng)早熟，而其他單殖吸蟲則是雄性生殖系統(tǒng)早熟。胎生的Macrogyrodactylus屬極少出現(xiàn)性早熟，需經(jīng)歷較長(zhǎng)的胚后分化，特別是體后部的腺組織和表皮細(xì)胞[35]，而Isancistrum屬的性早熟縮短生命周期，導(dǎo)致后吸器缺失中央大鉤和聯(lián)結(jié)片，其他系統(tǒng)也簡(jiǎn)化。胎生作為另外一種重要生殖適應(yīng)，可減少世代獲得時(shí)間，最終損失卵殼。

1.3 三代蟲的表皮和附著器

具有表皮合胞體的三代蟲物種包括G.gasterostei、G.eucaliae、G.turnbulli和G.bullatarudis等[35-36]。胎生種類的表皮有細(xì)胞核，而其他單殖吸蟲表皮無(wú)細(xì)胞核。G.eucaliae表皮細(xì)胞產(chǎn)生兩種不同的分泌囊泡[36]，而Macrogyrodactylusclarii產(chǎn)生3種囊泡[37]。三代蟲外胞質(zhì)層缺少細(xì)胞核、線粒體、高爾基體，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)僅出現(xiàn)在皮下細(xì)胞。

胎生三代蟲主要通過(guò)后吸器的邊緣小鉤附著，而中央大鉤和腹聯(lián)結(jié)片則作為分類結(jié)構(gòu)。寄主體表肌肉組織舒張時(shí)，三代蟲中央大鉤轉(zhuǎn)動(dòng)并移動(dòng)腹聯(lián)結(jié)片起到壓力板作用，防止后吸器和中央大鉤滑落[38]。較大的卵生三代蟲O.farlowellae需更強(qiáng)的附著力，防止從寄主體表滑落，因此以中央大鉤附著為主，而邊緣小鉤僅起輔助附著的作用[34]。G.poeciliae邊緣小鉤鉤尖長(zhǎng)度小于1 μm，容易從寄主體表滑落，而G.milleri牢固的邊緣小鉤可長(zhǎng)期附著在相同寄主體表[39]，因此三代蟲屬物種傾向于通過(guò)邊緣小鉤附著，中央大鉤用作壓力板，Isancistrum屬和Anacanthocotyle屬三代蟲缺少中央大鉤和聯(lián)結(jié)片，僅以邊緣小鉤附著[3,40]，而體更長(zhǎng)的Macrogyrodactylus、Swingleu、Polyclithrum、Mormyrogyrodactylus屬三代蟲則以后吸器附著[41]。寄生于爪蟾蜍(Xenopuslaevis)的三代蟲G.gallieni也以后吸器附著。

1.4 三代蟲體內(nèi)主要系統(tǒng)

消化系統(tǒng)：三代蟲主要以寄主的表皮細(xì)胞和黏液為食，腸兩側(cè)分支末端封閉，除Isancistrum屬外均具有合胞體[34,42]，而Isancistrum屬腸分支末端融合成環(huán)狀。三代蟲腸表皮無(wú)細(xì)胞核，而許多細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含不同的消化囊泡[43]。G.salaris直接以寄主表皮細(xì)胞為食，G.gasterostei每15～30 min進(jìn)食一次，可吞食一塊含30個(gè)細(xì)胞的表皮[6]。

腺系統(tǒng)：Wagener[44]首次描述三代蟲的腺體及分布，隨后Kritsky[45]將三代蟲G.eucaliae中的腺體分為3種類型：3對(duì)背部?jī)蓚?cè)對(duì)稱腺體群產(chǎn)生的酸性分泌物、1組咽之后的后腹部腺體分泌的顆粒酸性分泌物及1對(duì)前腹部腺體群產(chǎn)生堿性分泌物, 而頭腺主要起黏附作用。

排泄系統(tǒng)：包括2個(gè)縱向環(huán)狀通道和來(lái)自單個(gè)焰細(xì)胞的接收小導(dǎo)管，焰細(xì)胞和導(dǎo)管結(jié)構(gòu)與其他扁形動(dòng)物的相似[14]。

神經(jīng)系統(tǒng)：早期使用硫代膽堿法描述三刺魚(Gasterosteusaculeatus)的未命名三代蟲的神經(jīng)系統(tǒng)[46]，隨后通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)揭示G.salaris存在正交神經(jīng)索特征[47]，而共聚焦掃描電鏡揭示M.clarii的肌肉空間排列和相關(guān)膽堿、肽和胺類神經(jīng)分布[48]。

生殖系統(tǒng)：三代蟲的雄性生殖系統(tǒng)由睪丸和雄性生殖器組成。球形的雄性生殖器由前列腺和射精管組成交配囊，內(nèi)含大刺和小刺。卵生Ooegyrodactylus屬和非洲胎生三代蟲屬具有管狀雄性生殖器[49]；Mormyrogyrodactylus屬具有觸須形管狀結(jié)構(gòu)[41]，可延伸到體外，功能類似雄性外生殖器；Nothogyrodactylus、Aglaiogyrodactylus、Onychogyrodactylus屬的雄性生殖器周圍包括輔助的骨片。卵生屬具有2個(gè)形狀不同的精囊[50]，而胎生屬的精囊僅1個(gè)。卵生的O.farlowellae雌性生殖系統(tǒng)包括位于睪丸之后的1個(gè)卵巢，通過(guò)雌性輸卵管向體外側(cè)開(kāi)口，開(kāi)口作為成體的陰道，受精即雄性生殖器插入陰道[34]，卵黃腺未完全發(fā)育。胎生三代蟲最明顯的是子宮，卵巢則簡(jiǎn)化為精巢的后壁，缺乏獨(dú)立連接的雌性或雄性生殖系統(tǒng)通道。

三代蟲的子代突破體壁[35]，之后體壁愈合，留下永久的雌性開(kāi)口。G.turnbulli直接將雄性生殖器插入同種三代蟲體內(nèi)，開(kāi)始交配，雄性生殖器抓緊對(duì)方后相互受精[51]，而卵生三代蟲的受精則是雄性生殖器直接插入對(duì)方的子宮孔[35]。

2 三代蟲形態(tài)分類

三代蟲的形態(tài)分類主要依據(jù)后吸器中央大鉤和背腹聯(lián)結(jié)片，其中腹聯(lián)結(jié)片在識(shí)別新種上起決定作用。影響中央大鉤和聯(lián)結(jié)片發(fā)育的因素包括季節(jié)、寄主和附著位點(diǎn)[52]，其中低溫能延長(zhǎng)胚胎發(fā)育時(shí)間，是導(dǎo)致三代蟲中央大鉤變大的一個(gè)因素。

1946年Sproston僅通過(guò)邊緣小鉤識(shí)別秀麗三代蟲或中型三代蟲(G.medius)，但該方法不可靠，產(chǎn)生了許多錯(cuò)誤記錄[53]。直至1970年Malmberg[33]首次基于排泄系統(tǒng)并補(bǔ)充邊緣小鉤作為鑒定依據(jù)，正式提出三代蟲屬的分類系統(tǒng)，將其分為六個(gè)亞屬：三代蟲亞屬(Gyrodactylus)、Mesonephrotus、Paranephrotus、Metanephrotus、Neonephrotus和Limnonephrotus，但該分類系統(tǒng)基于寄主和寄生蟲的協(xié)同進(jìn)化，缺點(diǎn)是缺乏單獨(dú)特征來(lái)確定排泄系統(tǒng)的進(jìn)化方向，物種分布僅限于歐洲斯堪的納維亞半島，且只能研究活體，而許多北美洲和亞洲物種可能屬于已存在的種群，但未被完整描述而難以證實(shí)。

2.1 三代蟲科的分類

三代蟲科最初僅包括胎生的三代蟲屬，之后Fuhrmann[54]發(fā)現(xiàn)，Isancistrinae亞科Isancistrum屬缺少中央大鉤和聯(lián)結(jié)片，Polyclithrinae亞科Polyclithrum屬的后吸器出現(xiàn)較多的聯(lián)結(jié)片，其他屬統(tǒng)稱為三代蟲亞科，但這些亞科主要基于形態(tài)分類，可能并未真實(shí)反映物種關(guān)系。根據(jù)生殖方式的不同，三代蟲科分為卵生和胎生兩科，后期研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)立的卵生科Ooegyrodactylidae為并系群[34]，因此卵生科應(yīng)屬于三代蟲科[6]。目前三代蟲科包括4個(gè)亞科：Isancistrinae、Gyrdactylinae、Macrogyrodactylnae和三代蟲亞科[1]。

2.2 三代蟲屬的分類

根據(jù)形態(tài)分類標(biāo)準(zhǔn)及繁殖方式差異，三代蟲科分為30個(gè)屬[6]，包括7個(gè)卵生屬(Aglaiogyrodactylus、Hyperopletes、Ooegyrodactylus、Phanerothecium、Phanerothecioides、Nothogyrodactylus和Onychogyrodactylus)和23個(gè)胎生屬(Afrogyrodactylus、Accessorius、Acanthoplacatus、Anacanthocotyle、Archigyrodactylus、Fundulotrema、Gyrdicotylus、Gyrodactyloides、三代蟲屬、Isancistrum、Macrogyrodactylus、Mormyrogyrodactylus、Neogyrodactylus、Neogyrodactylus、Metagyrodactylus、Polyclithrum、Micropolyclithrum、Scleroductus、Swingleus、擬三代蟲屬、Paragyrodactylus、Paragyrodactyloides和薄片吸蟲屬)，其中胎生屬中的7個(gè)屬由于重名或同物異名，屬于無(wú)效命名，分別為：Paragyrodactyloides、Neogyrodactylus、Neogyrodactylus、Micropolyclithrum、Fundulotrema、Metagyrodactylus和Afrogyrodactylus[6,55-56]。因此三代蟲科有效屬為23個(gè)，包括7個(gè)卵生屬和16個(gè)胎生屬，其中卵生屬三代蟲僅感染南美的條紋鴨嘴鲇(Pseudoplatystomafasciatum)和蜥形克隆甲鲇(Kronichthyslacerta)，國(guó)內(nèi)三代蟲科僅包括三代蟲屬、薄片吸蟲屬和擬三代蟲屬[9-10]。胎生屬中體長(zhǎng)最短的Isancistrum屬約0.1 mm、三代蟲屬約0.6 mm、最長(zhǎng)的Macrogyrodactylus屬約1.5 mm。擬三代蟲屬和三代蟲屬的主要區(qū)別在于中央大鉤基部具有類似頭盔狀的骨片[9]。

3 三代蟲的分子標(biāo)記

1991年Wilson[57]用分子標(biāo)記研究三代蟲分類學(xué)和系統(tǒng)學(xué)，隨著致病性的G.salaris威脅擴(kuò)大，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法難以鑒定該物種，隨后使用分子標(biāo)記鑒定致病和其他非致病性的G.salaris[58]。津巴布韋、南非、墨西哥和中國(guó)等國(guó)家的學(xué)者也使用分子標(biāo)記研究本地三代蟲，發(fā)現(xiàn)了許多新種[8-9,59]。

3.1 核內(nèi)分子標(biāo)記

首個(gè)分子標(biāo)記是核內(nèi)核糖體18S rDNA的V4可變區(qū)，用于鑒別致病性的G.salaris和非致病性的G.truttae及G.derjavini，但難以區(qū)分G.thymalli和G.teuchis。隨后提出測(cè)定內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)和核糖體5.8S rDNA，其中序列高度保守的5.8S rDNA成為屬內(nèi)鑒定的合適標(biāo)記[60]。也有研究使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)構(gòu)建三代蟲屬系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系[61]，同時(shí)通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的屬級(jí)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系可用于評(píng)價(jià)亞屬和種群的有效性[60]，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列還可用于驗(yàn)證基于排泄系統(tǒng)和邊緣小鉤確立的三代蟲亞屬分類系統(tǒng)，支持三代蟲亞屬、Neonephrotus和Limnonephrotus亞屬為單系群，未支持其他3個(gè)亞屬作為單系群[6]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)比28S變異大，優(yōu)于V4可變區(qū)，已使用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)測(cè)定128個(gè)種，比較適合歐亞淡水魚類的G.wageneri種團(tuán)[6,8-9]。

核內(nèi)分子標(biāo)記也存在一些不足：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列變異大，存在插入或缺失，不適合屬級(jí)系統(tǒng)進(jìn)化分析，適合復(fù)雜的種內(nèi)鑒定；5.8S rDNA更適合屬級(jí)比較，但序列太短；18S rDNA的V4可變區(qū)包含充足的變異，但序列也較短；序列較長(zhǎng)的18S和28S更適合科級(jí)水平系統(tǒng)進(jìn)化；核糖體基因間隔區(qū)仍存在協(xié)同進(jìn)化的制約，也未能成為單獨(dú)的分子標(biāo)記。

3.2 線粒體基因分子標(biāo)記

用線粒體基因標(biāo)記分析三代蟲G.salaris進(jìn)化的是COⅠ基因[62]，與核糖體基因標(biāo)記相比，COⅠ基因突變率高，進(jìn)化速率更快，可用于檢測(cè)內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)數(shù)據(jù)的有效性，也是重建三代蟲物種形成不可或缺的分子標(biāo)記，但受線粒體基因核復(fù)制數(shù)和假基因影響，仍需更多的分子標(biāo)記構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化分析和物種鑒定。目前還使用線粒體NA5和COⅡ基因研究三代蟲分類及譜系地理[22，63]。

4 三代蟲線粒體基因組

目前已測(cè)定9種三代蟲的全線粒體基因組，包括卵生Aglaiogyrodactylus屬1種，胎生的三代蟲屬7種和擬三代蟲屬1種，分別為G.thymalli、G.salaris、G.derjavinoides、G.kobayashii、G.brachymystacis、G.parvae、G.gurleyi、Paragyrodactylusvariegatus和Aglaiogyrodactylusforficulatus[64-65]。線粒體基因組長(zhǎng)度為14 371～14 790 bp，均包含12個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因、2個(gè)核糖體RNA基因及1～2個(gè)不等的非編碼區(qū)。最短的卵生屬A.forficulatus為14 371 bp，2個(gè)非編碼區(qū)序列長(zhǎng)度分別為485 bp和733 bp，A+T的總含量為75.12%；中等長(zhǎng)度的胎生擬三代蟲屬P.variegatus為14 517 bp，1個(gè)主要的非編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1093 bp，A+T的總含量為76.3%，最長(zhǎng)的為胎生三代蟲屬G.salaris為14 790 bp，2個(gè)非編碼區(qū)序列長(zhǎng)度分別為799 bp和768 bp，A+T的總含量為65%，明顯低于A.forficulatus和P.variegatus。卵生屬A.forficulatus線粒體基因組長(zhǎng)度最短，其次為胎生擬三代蟲屬P.variegatus，最長(zhǎng)的為胎生三代蟲屬G.salaris。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，卵生屬A.forficulatus位于三代蟲科最基部，之后為擬三代蟲屬P.variegatus，最后為三代蟲屬物種[65]。

5 形態(tài)結(jié)合分子分類

目前三代蟲的分類主要根據(jù)后吸器中央大鉤和聯(lián)結(jié)片的形態(tài)特征及測(cè)量數(shù)據(jù)并結(jié)合分子標(biāo)記，主要用于鑒定新種和對(duì)已知種的分子確認(rèn)及研究基因流、遺傳漂變、種群分化，探討形態(tài)特征是否真實(shí)反映物種進(jìn)化，還是屬內(nèi)或種內(nèi)多樣性及環(huán)境影響[59, 66-67]。其中基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)rDNA序列推斷三代蟲屬4個(gè)亞屬的系統(tǒng)進(jìn)化表明，每個(gè)三代蟲屬亞屬都有唯一的5.8S基因序列，同時(shí)種的水平上表現(xiàn)在后吸器形態(tài)和尺寸差異很低，但內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的分子差異卻很高，因此可用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)鑒定物種[68]。此外，通過(guò)測(cè)量后吸器中央大鉤及邊緣小鉤的主要參數(shù)并結(jié)合分子標(biāo)記研究津巴布韋、南非、墨西哥、保加利亞、中國(guó)等國(guó)家本地三代蟲，發(fā)現(xiàn)了許多新種[8-9，11-12，59，66-69]。因此，通過(guò)形態(tài)學(xué)測(cè)量后吸器的骨化結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征并結(jié)合分子標(biāo)記仍然是未來(lái)鑒定三代蟲新種的主要方法。

6 展 望

三代蟲研究已取得的進(jìn)展包括建立屬級(jí)和科級(jí)分類系統(tǒng)、鑒定許多新種及開(kāi)展相關(guān)譜系地理研究，但這對(duì)于潛在超過(guò)20 000種的三代蟲分類和疾病防治還存在很大差距，特別是國(guó)內(nèi)許多省區(qū)三代蟲研究還存在空白。今后應(yīng)加強(qiáng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子數(shù)據(jù)聯(lián)合的生物學(xué)和分類學(xué)研究，尋找更多特異性分子標(biāo)記，對(duì)其分布、傳播、繁殖以及室內(nèi)培養(yǎng)等進(jìn)行深入研究、并逐步完善國(guó)內(nèi)分類系統(tǒng)，為三代蟲的生物學(xué)、分類學(xué)、新種鑒定及病害防治提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。