楊 琦，董然然，冉 嚴(yán)，張 堯，白天泉

( 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025 )

壬基酚廣泛用于洗滌劑、除草劑、殺蟲劑、增塑劑、乳化劑、潤濕劑、涂料助劑、化妝品、紡織助劑和石油制品中，是一種典型的環(huán)境激素，具有毒性、生物累積性、雌激素活性和持久性。在水、大氣、土壤以及食品中均有壬基酚分布的報道，尤其是在水中的報道最多，歐洲、美洲、亞洲和非洲的多條河流中均檢測到了壬基酚[1-4]。

目前，壬基酚對硬骨魚類影響的研究主要集中在生殖毒性和生物累積方面[5-14]，而其對魚類生態(tài)毒性方面的研究較少。筆者以生長速度快、抗病力強、肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)價值豐富的雜交鱘(Acipenserschrenckii♀×A.baerii♂)為研究對象[15]，在不同含量壬基酚溶液中浸浴后，檢測雜交鱘血液生理生化指標(biāo)、肝臟指數(shù)、肝糖原和肌糖原含量的變化，以期豐富環(huán)境激素對魚類生態(tài)毒理方面的研究，引起公眾對環(huán)境激素的廣泛關(guān)注，為保護野生鱘魚提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用雜交鱘購自遵義綏陽縣芙蓉江鱘魚繁養(yǎng)有限公司，體質(zhì)量為(59.16±4.18) g。實驗室暫養(yǎng)7 d。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

將壬基酚溶于95%乙醇中，配成2 mg/mL的母液，浸浴處理時，分別向含100 L水魚缸中加入1、2、4 mL 壬基酚母液，使水中壬基酚的終質(zhì)量濃度分別為25、50、100 μg/L。

試驗包括1個對照組和25、50、100 μg/L 3個處理組，每個處理組設(shè)3個重復(fù)。自暫養(yǎng)7 d的雜交鱘中，選取80尾健康個體隨機分至各組，每組8尾，浸浴28 d。浸浴期間,每日9:00和17:00飽食投喂，水溫為18～20 ℃，溶解氧6～8 mg/L，pH 約7.5。浸浴結(jié)束后，稱量每尾魚的體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量，抽取雜交鱘尾靜脈血檢測血液生理生化指標(biāo)，取肝臟和背部肌肉檢測糖原的含量。

1.2.2 指標(biāo)測定

血液生理指標(biāo)的測定：用2 mL注射器抽取雜交鱘血液，一份直接保存至1.5 mL離心管中，用于制備血清；另一份保存至含有肝素的1.5 mL離心管中，4 ℃保存?zhèn)溆?，用于計算紅細(xì)胞數(shù)目和血紅蛋白的含量。紅細(xì)胞計數(shù)采用血球計數(shù)板(25×16格)在顯微鏡下計數(shù)。血紅蛋白的含量采用堿化比色法測定。

血液生化指標(biāo)的測定：血糖濃度、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性采用北京索萊寶生物科技有限公司試劑盒測定，操作流程按試劑盒說明書進行。

糖原含量的測定：肝糖原含量的測定采用蒽酮比色法，肌糖原的含量采用南京建成生物工程研究所的肌糖原測定試劑盒。以上所有指標(biāo)的測定均設(shè)置3個以上重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)的計算及處理

紅細(xì)胞血紅蛋白含量和肝臟指數(shù)按下式計算：

Hm=ρB/n

n1=m1/m×100%

式中，Hm為每個紅細(xì)胞血紅蛋白含量(pg/個)，ρB為血紅蛋白含量(g/L)，n為紅細(xì)胞數(shù)目(1012個/L)；n1為肝臟指數(shù)，m1為肝臟質(zhì)量(g)，m為體質(zhì)量(g)。

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Excel 2013和IBM SPSS 21統(tǒng)計軟件進行整理和分析；各組數(shù)據(jù)之間的多重比較采用單因素方差分析中的LSD和Ducan法，多重比較的顯著性水平為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 不同質(zhì)量濃度壬基酚對雜交鱘血液生理指標(biāo)的影響

試驗結(jié)果顯示，對照組和處理組雜交鱘的紅細(xì)胞數(shù)目無顯著差異(表2)(P>0.05)。壬基酚質(zhì)量濃度為100 μg/L時，血紅蛋白的質(zhì)量濃度最高，為(80.98±2.56) g/L，顯著高于其他組(P<0.05)，其他各組間血紅蛋白的質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05)(表1)。

壬基酚質(zhì)量濃度為0、25、50 μg/L和100 μg/L時，平均每個紅細(xì)胞中血紅蛋白含量分別為(183.31±13.47)、(194.28±8.76)、(174.46±6.67) pg/個和(237.02±6.44) pg/個，壬基酚質(zhì)量濃度為100 μg/L時，平均每個紅細(xì)胞中血紅蛋白含量顯著高于其他組(P<0.05)(表1)。其他各組間差異不顯著(P>0.05)。

表1 壬基酚對雜交鱘血液生理指標(biāo)的影響

注：同一列標(biāo)不同字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

2.2 不同質(zhì)量濃度壬基酚對雜交鱘血清生化指標(biāo)的影響

雜交鱘血清中葡萄糖的濃度隨著壬基酚質(zhì)量濃度的升高而增加(表2)。壬基酚質(zhì)量濃度為50、100 μg/L時，血糖濃度達到(4.18±0.17)、(4.73±0.44) mmol/L，顯著高于0和25 μg/L組(P<0.05)。但是，50 μg/L和100 μg/L組間以及0和25 μg/L組間血糖濃度差異不顯著(P>0.05)。

壬基酚質(zhì)量濃度為50 μg/L時，血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性為(25.24±1.02) U/L，顯著高于對照組(9.96±0.48) U/L(P<0.05)，且隨著壬基酚質(zhì)量濃度的增加(100 μg/L)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性也進一步增強(37.14±2.53) U/L(P<0.05)(表3)。

對照組和處理組雜交鱘血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性差異不顯著(P>0.05)。壬基酚質(zhì)量濃度為0、25、50 μg/L和100 μg/L時，谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性分別為(101.03±3.35)、(99.46±1.94)、(102.80±2.96) U/L和(104.04±2.34) U/L(表2)。

表2 壬基酚對雜交鱘血液生化指標(biāo)的影響

2.3 不同質(zhì)量濃度壬基酚對雜交鱘肝臟指數(shù)的影響

壬基酚質(zhì)量濃度為0、25、50 μg/L和100 μg/L時，雜交鱘肝臟指數(shù)分別為(2.01±0.11)%、(2.19±0.14)%、(3.24±0.09)%和(3.37±0.13)%。壬基酚質(zhì)量濃度為50 μg/L和100 μg/L時，雜交鱘肝臟指數(shù)顯著高于0和25 μg/L組(P<0.05)，而50 μg/L和100 μg/L組間以及0和25 μg/L組間肝臟指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

2.4 不同質(zhì)量濃度壬基酚對雜交鱘肝糖原含量的影響

壬基酚質(zhì)量濃度為0、25、50 μg/L和100 μg/L時，雜交鱘肝糖原含量分別為(22.74±1.99)、(18.82±1.38)、(13.81±1.41) mg/g和(15.65±1.67) mg/g。隨著壬基酚質(zhì)量濃度的增加，肝糖原的含量逐步減少。壬基酚質(zhì)量濃度為25 μg/L時，肝糖原的含量顯著低于對照組(P<0.05)，質(zhì)量濃度為50 μg/L和100 μg/L時，肝糖原含量顯著低于壬基酚質(zhì)量濃度為25 μg/L時(P<0.05)，但是這兩組間無顯著差異(P>0.05)(表3)。

壬基酚質(zhì)量濃度為0、25、50 μg/L和100 μg/L時，雜交鱘肌糖原含量分別為(2.09±0.07)、(2.11±0.11)、(2.05±0.09) mg/g和(1.88±0.03) mg/g，質(zhì)量濃度為100 μg/L時，肌糖原含量最低，顯著低于其他各組(P<0.05)，其他各組間肌糖原含量無顯著差異(P>0.05)(表3)。

表3 壬基酚對雜交鱘糖原及肝臟指數(shù)的影響

3 討 論

3.1 壬基酚對雜交鱘血紅蛋白含量的影響

血液生理指標(biāo)可以反映魚類的健康狀況和對周圍環(huán)境的適應(yīng)性，是重要的毒理學(xué)指標(biāo)[16-17]。紅細(xì)胞數(shù)目較多和血紅蛋白含量較高時，魚類紅細(xì)胞的攜氧能力、機體生命力和運動能力也相對較強[18]。養(yǎng)殖密度較高時，可以提高魚類血紅蛋白含量和紅細(xì)胞數(shù)目[19]；水體中溶解氧含量較低時，血紅蛋白含量和紅細(xì)胞數(shù)目減少[20]；氨氮含量較高時，魚體內(nèi)血紅蛋白的含量和紅細(xì)胞數(shù)目降低[21]。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染后，可以降低魚體內(nèi)血紅蛋白的含量[22]。環(huán)境激素苯并芘(a)和芘能夠提高魚類血紅蛋白的含量，但對紅細(xì)胞數(shù)目的影響不顯著[23]。本研究中，100 μg/L試驗組顯著提高了雜交鱘血紅蛋白的含量，可能跟加速壬基酚代謝有關(guān)，但3個處理組均未顯著影響紅細(xì)胞的數(shù)目。

3.2 壬基酚對雜交鱘谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是生物體內(nèi)活力最強的轉(zhuǎn)氨酶，正常個體中，這兩種酶的活性較低，一旦組織受到損傷或發(fā)生病變，酶活性才會增強[24]。研究顯示，敵敵畏和氟氯氰菊酯可以誘導(dǎo)草魚(Ctenopharyngodonidella)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的表達[25]。對中華倒刺鲃(Spinibarbussinensis)和川鰈(Platichthysflesus)的研究表明，血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性隨著多環(huán)芳烴含量的增加而增強[26-27]。本研究中，隨著壬基酚質(zhì)量濃度的增加，谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性增強；各組間谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性無顯著差異。雖然只有谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性增強，但也表明雜交鱘的肝臟組織已受到壬基酚的損傷。

3.3 壬基酚對雜交鱘肝臟指數(shù)的影響

魚類肝臟指數(shù)常用作檢測水體污染的指標(biāo)，肝臟指數(shù)升高，表明肝臟遇到有毒有害物質(zhì)，正在解毒。研究表明，環(huán)境激素可增加青鳉(Oryziaslatipes)[28]、中華倒刺鲃[27]的肝臟指數(shù)。本試驗中，50、100 μg/L處理組雜交鱘肝臟指數(shù)均升高，表明壬基酚可能已在雜交鱘體內(nèi)累積，肝臟已開始解毒。

3.4 壬基酚對雜交鱘能量代謝的影響

葡萄糖提供了機體內(nèi)代謝所需的大部分能量，是維持生命活動所必需的物質(zhì)。用壬基酚、可的松、石油餾出物和萘分別處理海鱸(Dicentrarchuslabrax)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)和虹鱒(Oncorhynchusmykiss)后，這4種魚體內(nèi)的血糖均顯著性升高[29-32]。還有研究顯示，環(huán)境有機污染物能增加斑馬魚(Daniorerio)血糖的濃度[33]。環(huán)境脅迫也會引起許氏平鲉(Sebastesschlegeli)和花鱸(Lateolabraxjaponicus)血糖濃度的升高[34]。本研究中，雜交鱘血糖濃度隨著壬基酚質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)升高的趨勢。血糖升高可能是肝糖原和肌糖原分解產(chǎn)生的葡萄糖進入到血液中，方便調(diào)動能量解毒。血糖濃度的升高主要來源于肝糖原的能量動員，肝糖原不足時，才會動員肌糖原。

虹鱒、胡子鲇(Clariasbatrachus)暴露于壬基酚和工業(yè)污水中，肝糖原含量顯著下降[35-36]。Tintos等[37]也指出，環(huán)境激素可以加速魚體內(nèi)糖原的分解，引起體內(nèi)糖原含量下降。本研究中，25 μg/L壬基酚引起肝糖原含量的降低；100 μg/L壬基酚才可引起肌糖原含量的降低。糖原含量降低的原因可能是肝臟解毒需要能量；血液中葡萄糖濃度的升高來源于糖原的分解。

4 結(jié) 論

本研究中，不同質(zhì)量濃度壬基酚浸浴可以顯著提高雜交鱘血紅蛋白含量和血糖濃度、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性和肝臟指數(shù)，降低肝糖原和肌糖原的含量。表明壬基酚進入魚體后，雜交鱘的肝臟已受到損傷，啟動了自身解毒系統(tǒng)。