王翀昊,王心童,朱 娜

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 神經(jīng)外科，北京100050；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科；3.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所)

烏頭堿為雙酯類生物堿，具有很強(qiáng)生理活性；藥理學(xué)研究表明其具有抗炎、麻醉鎮(zhèn)痛、擴(kuò)血管降壓、抑制腫瘤生長(zhǎng)等藥理作用[1]；尤其在外用鎮(zhèn)痛方面有其獨(dú)到之處，是蒙藥常用的制劑之一。但烏頭堿的毒性比較大，0.2 mg即可使人中毒，3-5 mg即可致死[2]；外用藥亦可通過(guò)皮膚累積吸收[3]。因此，烏頭堿的毒性研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。烏頭堿的心臟毒性目前已被廣泛和系統(tǒng)的研究，但其神經(jīng)毒性方面的研究較少，大多集中在臨床病例報(bào)道和癥狀描述方面，只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)以胎鼠為模型進(jìn)行了驗(yàn)證[4,5]，缺乏低劑量積累造成的慢性毒理研究，也缺乏烏頭堿神經(jīng)毒性的機(jī)制探索。

近年來(lái)，人們研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚作為模式生物進(jìn)行神經(jīng)毒性研究具有其他生物不可比擬的優(yōu)勢(shì)：斑馬魚神經(jīng)形成過(guò)程和機(jī)制以及對(duì)于藥物的反應(yīng)都與人具有高度相似性；與哺乳動(dòng)物相比，斑馬魚的繁殖周期短、實(shí)驗(yàn)成本低；斑馬魚胚胎通體透明，可直接應(yīng)用顯微鏡觀察其神經(jīng)細(xì)胞等。因此斑馬魚作為脊椎動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于藥物神經(jīng)毒性的研究[6-8]。本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑒?dòng)態(tài)研究烏頭堿在胚胎及幼魚發(fā)育早期的神經(jīng)毒性，并初步探討烏頭堿神經(jīng)毒性的可能作用機(jī)制，為烏頭堿的安全應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

烏頭堿購(gòu)于Target Mol公司，純度≥98%，分子式C34H47NO11，母液溶解于二甲基亞砜(DMSO)中，再以斑馬魚胚胎培養(yǎng)液稀釋至實(shí)驗(yàn)所需濃度，DMSO終濃度≤0．1%。

1.2 斑馬魚飼養(yǎng)和魚卵采集

實(shí)驗(yàn)AB系斑馬魚，魚體長(zhǎng)(30±5)(x±s)mm，體質(zhì)量(0.20±0.05)(x±s)g，取自北京大學(xué)生命科學(xué)研究院。參照Westerfield的方法養(yǎng)殖并繁殖斑馬魚。光周期14 h/10 h，水溫控制在(28±1)℃，溶解氧不低于4 mg/L，正常喂食，每天2次。成魚雌雄分開(kāi)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前16 h將親魚(雌雄比例1∶1)放入交配缸，次日晨取隔板使其自然交配。受精后6 h鏡下檢查，確定發(fā)育階段并選擇正常受精卵備用。

1.3 游泳行為觀察

將受精后6 h斑馬魚胚胎置于12孔板(20顆/孔)中，每孔分別加入4 ml的0 μM,0.1 μM,0.5 μM,1 μM,10 μM,100 μM 的烏頭堿溶液，每天更換1/2體積相應(yīng)濃度的烏頭堿溶液至受精后96 h。將直徑為10 cm的培養(yǎng)皿放置在如圖1A所示圓圈的薄板上，在顯微鏡下隨機(jī)選擇各濃度組的受精后96 h斑馬魚幼魚，將幼魚放置于圓心位置，用探針輕觸幼魚尾部，選擇每個(gè)濃度組幼魚10條，每條觸動(dòng)20次。記錄在測(cè)試周期內(nèi)幼魚連續(xù)游泳時(shí)穿越交叉線和內(nèi)同心圓線的次數(shù)。幼魚游泳活力與單位時(shí)間內(nèi)幼魚所游過(guò)的距離正相關(guān)[9]。

1.4 乙酰膽堿酯酶活測(cè)定

顯微鏡下剝離不同濃度烏頭堿作用的斑馬魚脊索，30條/組。加入5倍體積蛋白勻漿液(Tris-Cl 100 mmol/L,NaCl 50 mmol/L,KCl 30 mmol/L,EDTA 2 mmol/L,PMSF 2 mmol/L,1% Triton X-100,pH 7.5)冰上勻漿每組斑馬魚脊索組織，4℃ 800 g離心10 min；取勻漿液上清待測(cè)乙酰膽堿酯酶活性。具體參照Ellman的方法[10]。AChE活性單位定義：每毫克組織蛋白在37℃保溫6 min，水解體系中1 μmol 底物為1 個(gè)活力單位。按如下公式計(jì)算AChE 活力。組織勻漿中AChE 活性(U/mg Pr)=(OD 樣品-OD 對(duì)照)/(OD 標(biāo)準(zhǔn)-OD 空白)×1/樣品總蛋白濃度。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

2 結(jié)果

2.1 烏頭堿抑制幼魚游泳活力

分別以不同濃度的烏頭堿培養(yǎng)液(0 μM,0.1 μM,0.5 μM,1 μM,10 μM,100 μM)于胚胎期(0-4 d)持續(xù)給藥，然后換到正常培養(yǎng)液中，觀察幼魚5-8 d的游泳行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著烏頭堿濃度的增加，幼魚游泳活力逐漸減弱。如圖1所示，隨著幼魚發(fā)育時(shí)間的推進(jìn)，幼魚在5-8天穿越交叉線次數(shù)逐漸降低。當(dāng)烏頭堿濃度為0.1 μM時(shí)，幼魚穿越交叉線次數(shù)與無(wú)藥物組沒(méi)有明顯差別，但烏頭堿濃度達(dá)到0.5 μM,1 μM,10 μM,100 μM時(shí)，幼魚在5-8天穿越交叉線的次數(shù)與濃度與對(duì)照組相比在各個(gè)相應(yīng)時(shí)期均有明顯差別。說(shuō)明烏頭堿在達(dá)到一定濃度時(shí)，會(huì)抑制斑馬魚幼魚游泳活力。

圖1 不同濃度烏頭堿溶液中斑馬魚穿越交叉線次數(shù) (A)游泳行為檢測(cè)分區(qū)俯視圖 (B)不同濃度烏頭堿中斑馬魚穿越交叉線次數(shù)

2.2 烏頭堿導(dǎo)致幼魚軀干肌發(fā)育萎縮

對(duì)照幼魚的體肌節(jié)內(nèi)肌纖維排列整齊，兩種肌纖維分化明顯，其中白肌纖維數(shù)量占有明顯優(yōu)勢(shì) (圖2A)。暴露于低劑量(0.1 μM)的烏頭堿的環(huán)境中，肌纖維的排列和肌節(jié)長(zhǎng)度都沒(méi)有明顯地改變(圖2B)。烏頭堿濃度達(dá)到1 μM,時(shí)，幼魚軀干肌節(jié)內(nèi)白肌纖維數(shù)量減少，但仍然可以看到分化的紅白肌纖維(圖2C)；但烏頭堿劑量增至100 μM時(shí)，肌纖維的分化不再顯著，(圖2D)。在圖2E中，當(dāng)烏頭堿暴露濃度高于0.1 μM時(shí)，軀干肌節(jié)的長(zhǎng)度(0.5 μM,0.224±0.005 mm；1 μM,0.209±0.003 mm；10 μM,0.179±0.003 mm；100 μM ，0.137±0.004 mm) 明顯短于對(duì)照幼魚(0.254±0.006 mm)。

(A)DMSO(B)烏頭堿濃度0.1 μM(C)烏頭堿濃度1 μM(D)烏頭堿濃度100 μM (E)不同烏頭堿濃度導(dǎo)致肌節(jié)長(zhǎng)度變化統(tǒng)計(jì)圖

2.3 烏頭堿導(dǎo)致Rohon-Beard神經(jīng)元在發(fā)育早期的正常凋亡障礙

如圖3相差顯微鏡照片所示，烏頭堿作用于斑馬魚胚胎72 h后，溶劑對(duì)照組幼魚體內(nèi)幾乎觀察不到RB神經(jīng)元，神經(jīng)管背側(cè)沒(méi)有出現(xiàn)胞體巨大的細(xì)胞(圖3A)。當(dāng)暴露于有烏頭堿存在的環(huán)境，在幼魚的神經(jīng)管背側(cè)可以看到數(shù)量不等的RB細(xì)胞，其數(shù)量隨著烏頭堿處理劑量增加而上升(圖3B-D)。

2.4 烏頭堿通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶活性對(duì)斑馬魚胚胎和幼魚產(chǎn)生神經(jīng)毒性

為了揭示烏頭堿導(dǎo)致的上述兩個(gè)組織學(xué)異?，F(xiàn)象的原因，我們連續(xù)檢測(cè)了烏頭堿處理后3個(gè)發(fā)育時(shí)間點(diǎn)(24、48、72hpf)實(shí)驗(yàn)幼魚脊索總AChE活性水平(IU/pro)，測(cè)量結(jié)果匯總于圖4中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎暴露于烏頭堿72 h，烏頭堿濃度大于0.5 μM，即可導(dǎo)致孵化后的幼魚體內(nèi)的AChE活性顯著降低；提示我們?yōu)躅^堿可降低乙酰膽堿酯酶活性，抑制Rohon-Beard神經(jīng)元生理性凋亡，從而對(duì)斑馬魚幼魚產(chǎn)生神經(jīng)毒性。

(A)DMSO (B)烏頭堿濃度0.1 μM (C)烏頭堿濃度1 μM (D)烏頭堿濃度100 μM

圖4 烏頭堿對(duì)斑馬魚脊索神經(jīng)元乙酰膽堿酯酶活性的抑制

3 討論

烏頭堿具抗炎、麻醉鎮(zhèn)痛、擴(kuò)血管降壓、抑制腫瘤生長(zhǎng)等藥理作用，是臨床常見(jiàn)的重要藥物；但其中毒劑量很接近藥用劑量，因此，用藥需謹(jǐn)慎。烏頭堿的神經(jīng)毒性在體外模型上已有初步研究，但其神經(jīng)毒性缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。國(guó)際上常用斑馬魚作為模型檢測(cè)藥物潛在的神經(jīng)毒性效應(yīng)。本研究選擇模式生物斑馬魚為動(dòng)物模型研究烏頭堿的神經(jīng)毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)烏頭堿濃度大于0.5 μM時(shí)即可表現(xiàn)出輕微的毒性，具體體現(xiàn)在斑馬魚幼魚游泳活力減弱，肌節(jié)發(fā)育不良等表型。進(jìn)一步觀察胚胎發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)烏頭堿作用于斑馬魚胚胎72 h，即可導(dǎo)致斑馬魚發(fā)育時(shí)期正常凋亡的初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元(Rohon-Beard神經(jīng)元)凋亡障礙。乙酰膽堿酯酶在RB神經(jīng)元凋亡中扮演著重要角色[11]，而烏頭堿又是乙酰膽堿酯酶的天然抑制劑[12,13]，那么烏頭堿是否通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶活性導(dǎo)致RB神經(jīng)元凋亡障礙？通過(guò)檢測(cè)暴露于不同濃度烏頭堿的斑馬魚胚胎脊索乙酰膽堿酯酶活性，發(fā)現(xiàn)濃度大于0.5 μM的烏頭堿作用胚胎72 h后即可明顯抑制斑馬魚胚胎發(fā)育早期脊索組織中乙酰膽堿酯酶的活性；提示我們?yōu)躅^堿可能通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶活性對(duì)斑馬魚胚胎和幼魚產(chǎn)生神經(jīng)毒性。對(duì)于烏頭堿神經(jīng)毒性的研究，還需要更多的動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以便更好的對(duì)烏頭堿的臨床用藥進(jìn)行指導(dǎo)。