肖 霞，馬 慧，王 欣

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗科,吉林 長春130041)

結(jié)直腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，已成為我國第五大癌癥殺手，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢，臨床上大約40%的結(jié)直腸癌患者死于肝臟的轉(zhuǎn)移[1]。 大約15%-25%的結(jié)直腸癌患者在確診時即有肝轉(zhuǎn)移，如不采取有效治療，中位生存時間僅為5-10 個月。因此，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測及診斷在臨床上尤為重要。目前，臨床上常用的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的診斷指標(biāo)價值有限[2]。 因此，微創(chuàng)、準(zhǔn)確和可重復(fù)的檢測指標(biāo)迫切需要，血清或血漿作為臨床樣品為結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的早期預(yù)測提供了可能。

血清或血漿中微小RNA(micro RNAs，miRNAs)可以在不同的環(huán)境條件下，例如，pH、溫度和多次反復(fù)凍融后仍能長時間穩(wěn)定的存在，被認(rèn)為是一種理想的血液標(biāo)志物[3]。研究發(fā)現(xiàn)miR-21在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲過程[4]。因此，在本研究中，我們以期通過單獨及聯(lián)合評價血清中miR-21對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值，以期為臨床的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測提供一種潛在的輔助診斷方法。

1 對象與方法

1.1 研究對象

病例組：簽署患者知情同意書，募集2014年1月-2015年12月在本院就診的晚期結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移患者146例，其中女性62例，男性84例，平均年齡為56.2±10.7歲。同期納入晚期結(jié)直腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者124例，其中女性58例，男性66例，平均年齡為57.1±12.1歲。兩組比較后，年齡與性別均無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 miR-21的提取及檢測

采集患者清晨空腹血，離心后分離抽提上清得到血清。 miR-21的提取按照操作說明使用mirVana PARIS kit (AM1556，Ambion)試劑盒，提取200 μl血清的total RNA，Dnase I降解殘余的DNA，然后按照操作說明，使用TaqMan microRNA RT kit (4366596，Ambion)試劑盒進行miR-21的反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系包括2.5 μl的total RNA、0.75 μl的10×Reverse Transcription Buffer、 2.08 μl的DEPC水、0.075 μl的dNTPs、0.095 μL的反轉(zhuǎn)錄抑制酶、0.5 μl的反轉(zhuǎn)錄酶和1.5 μl的20×miRNA-specific primer)，發(fā)轉(zhuǎn)錄程序為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物后，按照操作說明，對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行擴增，miRNA-21的擴增體系包括5.0 μl的TaqMan Gene Expression Master Mix、4.5 μl 的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和 0.5 μl的 5×TaqMan MicroRNA Assay。擴增程序為95℃ 5min，然后40個cycel的95℃，15 sec，60℃ 1 min。內(nèi)參為U6 miRNA，使用ABI PRISM 7500進行miR-21和U6的檢測，2-ΔΔCt法計算miR-21的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計分析

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS21.0軟件分析，CEA的濃度以中位數(shù)表示，miR-21的相對表達(dá)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。miR-21和CEA聯(lián)合診斷采用二元Logistic回歸分析。受試者工作特征曲線下面積(Area under curve，AUC)，靈敏度和特異度評價指標(biāo)的預(yù)測價值。AUC的統(tǒng)計學(xué)比較采用z-score檢驗[5]。P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)價值。

2 結(jié)果

2.1 CEA和miR-21在兩組之間的比較

與結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組相比，結(jié)直腸癌伴隨肝轉(zhuǎn)移組的CEA和miR-21均顯著升高(P<0.05)。

表1 CEA和miR-21在結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組相比，結(jié)直腸癌伴隨肝轉(zhuǎn)移組的比較

2.2 CEA和miR-21單獨區(qū)分結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組和結(jié)直腸癌伴隨肝轉(zhuǎn)移組的診斷價值評價

當(dāng)CEA和miR-21單獨區(qū)分結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組和結(jié)直腸癌伴隨肝轉(zhuǎn)移組的診斷價值時，CEA的敏感性和特異性分別為54.84%和58.22%，miR-21的敏感性和特異性分別為69.35%和85.62%。

表2 CEA和miR-21單獨區(qū)分結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組和結(jié)直腸癌伴隨肝轉(zhuǎn)移組的診斷價值評價

2.3 CEA和miR-21聯(lián)合區(qū)分結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組和結(jié)直腸癌伴隨肝轉(zhuǎn)移組的診斷價值評價

當(dāng)CEA和miR-21聯(lián)合區(qū)分結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組和結(jié)直腸癌伴隨肝轉(zhuǎn)移組的診斷價值評價，其曲線下面積為0.86，置信區(qū)間為0.82至0.91。兩者聯(lián)合檢測后其敏感性和特異性分別為91.94%和51.23%，其AUC與CEA和miR-21的AUC相比較，均顯著提高(P<0.05)。

3 討論

結(jié)直腸癌的肝臟轉(zhuǎn)移是一個多因素及多基因參與、多步驟和多階段進展的過程。 經(jīng)過多年的研究，其可能的機制目前主要表現(xiàn)在以下幾方面：(1) 細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程，由于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移涉及到細(xì)胞外基質(zhì)的降解，通過與其表面的受體相結(jié)合形成腫瘤轉(zhuǎn)移的通道； (2) 調(diào)控血管生成類因子的生成。腫瘤可持續(xù)性生長的基礎(chǔ)是新生的血管，與此同時，新生血管形成引發(fā)的細(xì)胞粘附系統(tǒng)崩潰，使腫瘤癌細(xì)胞脫離原發(fā)組織，這是啟動腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵； (3) 細(xì)胞粘附的改變。腫瘤細(xì)胞間的同質(zhì)粘附力較弱，容易從原發(fā)灶中脫離從而發(fā)生轉(zhuǎn)移過程；(4) 趨化因子及其受體等其他相關(guān)因素[5,6]。雖然有大量的研究，然而，目前，臨床上尚缺乏有效的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)測標(biāo)志物。

圖1 CEA和miR-21聯(lián)合區(qū)分結(jié)直腸癌無肝轉(zhuǎn)移組和結(jié)直腸癌伴隨肝轉(zhuǎn)移組的診斷價值評價

CEA作為診斷和監(jiān)測結(jié)直腸癌預(yù)后的有效標(biāo)志物，作為結(jié)直腸癌術(shù)后的監(jiān)控指標(biāo)已作為標(biāo)準(zhǔn)檢測進入治療指南[7]。同時，CEA也可以用于判斷結(jié)直腸癌患者生存率及與肝轉(zhuǎn)移的關(guān)系[8]，大量的研究證實CEA參與結(jié)腸癌的肝臟轉(zhuǎn)移，且可以通過抵抗腫瘤細(xì)胞的凋亡來延長腫瘤細(xì)胞的生存期，還可以刺激并促進抗炎細(xì)胞因子進而抑制體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的殺傷。目前，有研究結(jié)果顯示CEA術(shù)前水平與患者的預(yù)后相關(guān)，但臨床診斷中利用術(shù)前CEA水平來評估結(jié)直腸癌肝臟轉(zhuǎn)移尚且存在一定的爭論。在本研究中，其用于區(qū)分結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移與否的診斷敏感性和特異性分別為54.84%和58.22%。這與之前的研究結(jié)果不同，可能由于本研究納入的樣本量較少及不同分期的標(biāo)本量有關(guān)。

miR-21基因作為最早被檢測到的miRNA基因之一，在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，有報道發(fā)現(xiàn)，在一些腫瘤細(xì)胞系中均發(fā)現(xiàn)miR-21基因表達(dá)上調(diào)。PDCD4作為miR-21的靶基因之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，通過下調(diào)癌基因的來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移[9]，因此 miR-21-PDCD4可能是一個重要的腫瘤發(fā)生發(fā)展的通路。PTEN也是miR-21的靶點之一，PTEN的抑癌作用主要通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路實現(xiàn)，miR-21通過調(diào)節(jié)PTEN，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡和血管生成等生物學(xué)功能[10]。在本研究中，miR-21作為區(qū)分結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移與否的診斷敏感性和特異性分別為69.35%和85.62%，具有一定的診斷價值。

本研究通過探討血清中miR-21對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值，評價其單獨檢測和聯(lián)合CEA檢測對于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的輔助診斷價值。證明miR-21對于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移具有一定的輔助診斷價值，與CEA聯(lián)合檢測可以為臨床結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測提供輔助診斷。