李 源,阮 焱*,舒 暢

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院，北京100026;2.中國(guó)科學(xué)院基因組科學(xué)與信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

在2013年研究發(fā)現(xiàn)在母體中可以檢測(cè)到來(lái)源于胎兒胎盤的RNA[1]。固有RNA的不穩(wěn)定性，提示可以通過(guò)防止其在血清中降解從而使循環(huán)RNA達(dá)到穩(wěn)定，甚至可以延長(zhǎng)RNA在凋亡小體中暴露于核酶的時(shí)間[2]。這一重要發(fā)現(xiàn)使循環(huán)RNA分子應(yīng)用于臨床，也使得性別或基因型等可以用于無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前基因表達(dá)分析。另發(fā)現(xiàn)所有胎盤來(lái)源的mRNA在分娩之后就被快速清除，這一證據(jù)表明了該目標(biāo)mRNA與妊娠過(guò)程相關(guān)[1]。miRNAs在胎盤中顯著表達(dá)，其可能在持續(xù)的妊娠過(guò)程中與胎盤分化相關(guān)。且胎盤miRNAs可在母體血漿中被檢測(cè)到[3]，這就提示其可做為新的胎兒核酸標(biāo)記物，因此其可用于監(jiān)控妊娠過(guò)程。

目前，用于妊娠早期胎兒心臟缺陷的診斷標(biāo)志物及相關(guān)技術(shù)在準(zhǔn)確性等方面仍然非常有限。因此，探尋有效、簡(jiǎn)便、快捷、高效而準(zhǔn)確的可替代性無(wú)創(chuàng)循環(huán)或組織學(xué)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)或診斷胎兒心臟缺陷的需求急為迫切[4]。本文旨在探討母血中microRNA-520a水平與胎兒心臟缺陷的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象與分組

收集2010年1月至2015年12月間于我院進(jìn)行系統(tǒng)產(chǎn)前檢查并超聲心臟檢查提示一處或多處先天性心臟缺陷胎兒的孕婦作為研究組，共44例；隨機(jī)收集同期同孕周胎兒未發(fā)現(xiàn)異常的孕婦作為對(duì)照組共34例。兩組的年齡為32.56±6.18歲，孕周為23.18±5.62周。全部參與者接收全程跟蹤隨訪，隨訪結(jié)果滿意。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。每位患者知情同意并簽署書面知情同意書，全部患者均同意其病例數(shù)據(jù)及標(biāo)本用于實(shí)驗(yàn)研究及論文發(fā)表。

1.2 標(biāo)本采集

使用EDTA (Ethylenedinitrilotetraacetic acid) 抗凝管采集靜脈血9 ml共兩管，800×g離心后取上清。所得上清使用Eppendorf Centrifuge 5810 R 離心機(jī)(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)再次4,800×g于4℃下離心10 min。經(jīng)過(guò)兩次離心后，所獲得的母體血漿上清標(biāo)本使用Eppendorf 凍存管于-80℃保存以備進(jìn)一步提取及分析miRNA 。

1.3 miRNA 提取

使用NucleoSpin○RmiRNA Plasma kit (Macherey-Nagel GmbH and Co.,KG,Düren,Germany)， 即血漿miRNA提取試劑盒提取miRNA，進(jìn)一步采用Nanodrop spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)檢測(cè)儀測(cè)定總miRNA濃度。每個(gè)純化后的標(biāo)本測(cè)定使用吸光度值比率表示(吸光度值=A260/280)。

1.4 定量RT-PCR檢測(cè)

在上述標(biāo)本中加入3.5 μl合成miRNA-39 (cel-microRNA-39)，其來(lái)源于秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)，用于跟蹤標(biāo)定對(duì)照，其工作濃度為1.6×108copies/μl。所提取miRNAs的定量和純度測(cè)定分別使用Agilent 公司的Agilent 2100 Bioanalyzer 和RNA 6000 Nano/Pico LabChip進(jìn)行相應(yīng)檢測(cè)。

進(jìn)一步采取定量RT-PCR的方法標(biāo)本中microRNA-520a的表達(dá)水平。為避免基因組DNA的污染及影響，首先采取如下措施以消除基因組DNA：(1)配制如下混合物--即5×gDNA Eraser緩沖液2.0 μl，1.0μl Gdna Eraser，然后加入微量總RNA后用RNase-free水補(bǔ)充至總量10.0 μl。(2)將前述混合物保持在42 ℃ 2 min，然后在4℃保存至進(jìn)一步使用。(3)應(yīng)用美國(guó)Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific公司的TaqMan microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(4366596)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，試劑體系為總量20.0 μl，其中包括上述去除基因組DNA的10.0 μl體系，另外再加入4.0 μl 5 × PrimeScript緩沖液，1.0 μl PrimeScript RTEnzyme混合物I，以及1.0 μl RT引物混合物，最后加入4.0 μl RNase-free水。(4)采取定量PCR方法使用PCR7900熱循環(huán)儀(Applied Biosystems Thermo Fisher Scientific公司)檢測(cè)microRNA水平。各檢測(cè)模板的目標(biāo)序列如表1所示。

表1 各檢測(cè)模板的目標(biāo)序列

PCR反應(yīng)體系總體積為20.0 μl，其中包括10.0 μl LightCycler 480 SYBR Green I混合物(德國(guó)，羅氏公司)，0.8 μl 正向PCR引物(10 μM)，0.8 μl反向PCR引物(10 μM)，1.0 μl cDNA模板(<100 ng)和7.4 μl RNase-free水。應(yīng)用LightCycler 480(德國(guó)，羅氏公司)執(zhí)行定量PCR檢測(cè)，反應(yīng)條件如下：在95℃下預(yù)變性5 min；95℃ 12 s，60℃ 8 s，72℃ 15秒為一個(gè)循環(huán)，共40個(gè)循環(huán)；溶解度曲線分析為95℃ 5 s、65℃ 60 s；最后在40℃下冷卻30 s。每個(gè)反應(yīng)進(jìn)行6次。采用德國(guó)Bio-Rad公司CFX Manager Software v2.1 軟件計(jì)算相對(duì)microRNA-520a表達(dá)水平，計(jì)算方法使用2-ΔΔCt法[5]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

全部試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0專用統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析用于確定組間差異。數(shù)據(jù)以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)形式表示。受試者工作特征曲線即ROC曲線是用來(lái)鑒別mirRNA-520a的預(yù)測(cè)能力。 所有P值采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05提示顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

通過(guò)運(yùn)用cel-microRNA-39的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，結(jié)果顯示研究組microRNA-520a的血漿表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(2.732±0.075)×10-2ng/ml vs (2.096±0.084)×10-2ng/ml；P<0.001，見圖1。 ROC曲線下面積(AUC)結(jié)果為0.92 (95%可信區(qū)間為0.86-0.97；P<0.001) (見圖2)。提示microRNA-520a在胎兒心臟缺陷兒的母體血漿中的表達(dá)水平顯著升高。

Y軸單位為10-2 ng/ml

3 討論

新的非侵入性檢測(cè)生物標(biāo)志物對(duì)早期診斷胎兒的遺傳性疾病具有重大的臨床價(jià)值，其可能顯著改善早期診斷胎兒遺傳性疾病的準(zhǔn)確性。MicroRNAs已被諸多研究證實(shí)，其在人類的發(fā)育過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[6]。Lazar等研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs與胎兒心臟發(fā)育密切相關(guān)[7]。

已有研究證實(shí)，microRNA-520/373是聯(lián)系TGF-β和NF-κB通路之間的重要因素，其可能導(dǎo)致炎癥、影響腫瘤的轉(zhuǎn)移或進(jìn)展過(guò)程[8]。miR-520-3p通過(guò)靶向MAP3K2，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，miR-520-3p在臨床上可以作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后標(biāo)志物[9]。Mamczarz等證明過(guò)表達(dá)miR-520c-3p抑制細(xì)胞增殖及其全部基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)DLBCL細(xì)胞的未成熟衰老過(guò)程，過(guò)表達(dá)miR-520c-3p可以抑制人類異種移植瘤在小鼠模型體內(nèi)的生長(zhǎng)過(guò)程[10]。

圖2 ROC曲線下面積(AUC)分析

本研究microRNA-520a作為非侵入性診斷標(biāo)志物在胎兒先天性心臟缺陷的臨床診斷中的價(jià)值及意義。本研究中采用定量RT-PCR方法檢測(cè)microRNA-520a在78例妊娠期母親血漿中的表達(dá)水平，其中44例母親分娩胎兒后隨訪發(fā)現(xiàn)心臟先天性缺陷，而對(duì)照組34例胎兒心臟狀態(tài)正常。本結(jié)果提示，microRNA-520a在先天性心臟缺陷患兒母親血漿中的表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比顯著上升 (P<0.001)，ROC特征曲線下面積(AUC)為0.92 (95%可信區(qū)間為0.86-0.97；P<0.001)。研究提示，microRNA-520a的血漿表達(dá)水平與胎兒心臟缺陷存在一定的關(guān)系。因此，本研究提示microRNA-520a有可能作為組合性miRNA評(píng)估指標(biāo)之一，母血microRNA-520a表達(dá)水平可能作為妊娠期胎兒的先天性心臟缺陷的非侵入性輔助診斷標(biāo)志物，用于妊娠期胎兒的先天性心臟缺陷的早期篩查與評(píng)估。

在胚胎發(fā)育的過(guò)程中，心臟發(fā)育屬于其中一部分且是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，與細(xì)胞多種生物學(xué)過(guò)程相關(guān)，包括細(xì)胞遷移、細(xì)胞黏附以及細(xì)胞周期等過(guò)程。心臟發(fā)育也涉及了多種理化過(guò)程，因此也受到相關(guān)因素的影響與調(diào)控。心臟的發(fā)育過(guò)程中，各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其相關(guān)的關(guān)鍵通路蛋白及調(diào)控因子均參與其中，也包括多種生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子[11]。而miRNAs作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的關(guān)鍵因素之一，其雖為非編碼RNA,但可通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)起到直接使靶基因的mRNA降解或使之翻譯過(guò)程受到顯著抑制而發(fā)揮其細(xì)胞生物學(xué)功能。miRNAs廣泛參與的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程，對(duì)心臟發(fā)育也至關(guān)重要[12，13]。

在本研究中，本課題組首次通過(guò)一定樣本量的實(shí)驗(yàn)研究了母血microRNA-520a水平與胎兒心臟缺陷的關(guān)系，為臨床篩查與診斷胎兒心臟出生缺陷提供新的輔助指標(biāo)。