梅瑾 盧莎 王昊 陳益明 王小華

不良妊娠結(jié)局包括流產(chǎn)、死胎、早產(chǎn)、胎兒畸形及先天性出生缺陷等，嚴重影響人口健康素質(zhì)和社會經(jīng)濟發(fā)展。目前關(guān)于不良妊娠結(jié)局的原因尚不十分清晰，有研究表明遺傳因素與其有關(guān)，并涉及到相關(guān)基因的突變[1]。近年來，與葉酸代謝密切相關(guān)的亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）的單核苷酸多態(tài)性與自然流產(chǎn)、出生缺陷、腫瘤性疾病的關(guān)系也被越來越多的學者所研究[2-4]。本研究通過檢測不良妊娠結(jié)局患者與正常人群外周靜脈血基因組DNA MTHFR基因位點的多態(tài)性，分析MTHFR基因突變與出生缺陷及自然流產(chǎn)的相關(guān)性，為降低不良妊娠結(jié)局發(fā)生率制定個性化干預措施提供循征醫(yī)學證據(jù)。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年4月至2016年4月來本院就診的曾有不良妊娠結(jié)局的育齡期婦女242例為研究組，不良妊娠結(jié)局類型包括自然流產(chǎn)、胚胎停育、神經(jīng)管缺陷、無腦兒、腦積水、腦癱、染色體病、先天性智力低下、先天性心臟病、唇腭裂、四肢畸形等。選取同期來院就診的無不良妊娠史的育齡期婦女339例為對照組。入選標準：（1）婦科檢查、B超檢查等已排除生殖系統(tǒng)解剖畸形；（2）無甲狀腺功能亢進/減退、糖尿病等內(nèi)分泌相關(guān)疾??；（3）TORCH檢測IgM陰性；（4）抗磷脂相關(guān)抗體、自身抗體、抗精子抗體等生殖免疫抗體均為陰性；（5）ABO及Rh血型無溶血；（6）無家族性遺傳病史；（7）無惡性腫瘤及其他全身性疾病。研究組年齡19～40（29.52±3.79）歲，BMI（22.68±2.17）kg/m2；對照組年齡 20～40（29.79±5.11）歲，BM（I22.76±2.59）kg/m2；兩組對象年齡和BMI比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準和患者知情同意。

1.2 標本采集 抽取受檢者外周靜脈血2ml，加入含乙二胺四乙酸抗凝劑的采血管內(nèi)混勻。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 從外周靜脈血中提取DNA，所用的DNA微量樣本基因組提取試劑盒購于德國羅氏公司（批號23655500），操作步驟按照試劑盒說明書進行。為了保證實驗結(jié)果的準確性，以健康者外周血及無核酸蒸餾水為陰性對照和空白對照。

1.3.2 MTHFR基因檢測 采用熒光定量PCR法分析MTHFR基因C677T和A1298C兩個位點單核苷酸多態(tài)性的基因型，所用儀器為Light Cycler480（德國羅氏公司）。實驗反應體系中探針工作液2μl、引物工作液1μl、5X LightCycler master mix 4μl、分子級無菌水 10μl、DNA 3μl。擴增循環(huán)條件：95℃預變性10min，1個循環(huán)；95℃變性 5s，57℃退火 10s，72℃延伸 15s，45 個循環(huán)；反應結(jié)束后通過Light Cycler480的 Gene Scanning軟件（1.5 version）對熔解曲線進行分析，溶解曲線條件：95℃維持1min，45℃維持1min，從45℃以0.14℃/s的升溫速率升溫至68℃，并且在此階段采集熒光信號。每次檢測同時帶有3個標準品、2個陽性對照及1個陰性對照。采用雙盲法對所有樣本進行分型，并從所有樣本中隨機抽取10%的樣本進行重復驗證。

表2 兩組A1298C位點基因型和等位基因頻率分布[例（%）]

表1 兩組C677T位點基因型和等位基因頻率分布[例（%）]

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。兩組MTHFR C677T和A1298C兩個位點的基因型頻率分布比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組不良妊娠結(jié)局分析 胎兒染色體?。ò?1-三體、18-三體、13-三體等三體染色體病及單體染色體病、性染色體?。?6例（23.2%），神經(jīng)系統(tǒng)異常（包括神經(jīng)管缺陷、無腦兒、腦積水、腦癱、先天性智力低下等神經(jīng)系統(tǒng)異常相關(guān)疾?。?5例（10.3%），先天性心臟病25例（10.3%），四肢畸形 4例（1.7%），唇腭裂1例（0.4%），不明原因流產(chǎn)或胚胎停育131例（54.1%）。

2.2 兩組C677T位點基因型和等位基因頻率分布 研究組C677T位點的CC野生純合型頻率低于對照組，TT突變純合型頻率高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而兩組CT突變雜合型頻率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組C、T等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表 1。

2.3 兩組A1298C位點基因型和等位基因頻率分布研究組A1298C位點的AA野生純合型頻率低于對照組，CC突變純合型頻率高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而兩組AC突變雜合型頻率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。兩組A、C等位基因頻率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

2.4 兩組C677T和A1298C聯(lián)合基因型頻率分布比較本研究進一步分析了MTHFR的C677T和A1298C兩個位點的聯(lián)合基因型頻率分布，結(jié)果顯示研究組CC/CC、CT/CC、TT/AC聯(lián)合基因型頻率顯著高于對照組，而CC/AA和CT/AA聯(lián)合基因型頻率顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 兩組C677T和A1298C聯(lián)合基因型頻率分布比較[例（%）]

3 討論

葉酸是體內(nèi)重要的甲基供體，葉酸代謝途徑的正常運轉(zhuǎn)對于維持DNA正常甲基化、DNA從頭合成以及DNA修復至關(guān)重要。MTHFR基因編碼的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化5，10亞甲基四氫葉酸為5甲基四氫葉酸，為機體的正常甲基化過程提供甲基基團。MTHFR基因位于人類染色體1p36.3，編碼656個氨基酸，包括11個外顯子和10個內(nèi)含子[3]，MTHFR基因編碼MTHFR蛋白，是葉酸代謝的關(guān)鍵酶。該基因具有高度保守性，目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MTHFR基因有近20種基因多態(tài)性突變位點，其中最具有臨床意義的兩個突變位點是C677T和A1298C。C677T突變表現(xiàn)為3種基因型，即CC、CT和TT型；A1298C突變表現(xiàn)為3種基因型，即AA、AC和CC型。

C677T位點突變的CT突變雜合型可使酶的活性下降35%，TT突變純合型可使酶的活性下降70%，影響葉酸的正常代謝，進而導致DNA低甲基化，干擾DNA合成和DNA損傷修復，造成DNA鏈斷裂、染色體重組改變和分離異常；同時可引起血管內(nèi)皮細胞損傷和功能異常，激活血小板的黏附和聚集[5]，導致胎盤血栓性病變，被認為是不明原因流產(chǎn)的危險因素之一[6]。

孕婦對葉酸的需求量為常人的2～3倍，一旦MTHFR基因發(fā)生突變而導致其對葉酸的利用能力降低，容易導致胎兒神經(jīng)管畸形、唇腭裂、唐氏綜合征、自發(fā)性流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)及新生兒低出生體質(zhì)量等葉酸代謝相關(guān)的疾病發(fā)生風險增高，還可造成孕婦妊娠期高血壓疾病、胎盤早剝、貧血等妊娠并發(fā)癥的發(fā)生[7]。

本研究表明兩組C677T位點的CC型、TT型及A1298C位點的AA型、CC型頻率比較差異均有統(tǒng)計學意義，而兩組C677T位點的CT突變雜合型及A1298C位點的AC突變雜合型頻率比較差異均無統(tǒng)計學意義。提示等位基因的純合突變與不良妊娠結(jié)局可能有關(guān)，而等位基因的雜合突變與不良妊娠結(jié)局的影響在統(tǒng)計上不相關(guān)，這可能與雜合型突變使酶的活性下降不如純合型明顯有關(guān)。根據(jù)以上結(jié)果推測，MTHFR基因多態(tài)性是不良妊娠發(fā)生的遺傳易感性因素，尤其是等位基因發(fā)生純合突變會增加發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風險。劉念等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不良孕產(chǎn)史孕婦MTHFR基因C677T位點的TT型突變、A1298C位點的CC型突變基因頻率均高于對照組，與本研究結(jié)果類似。王賢軍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因C677T位點的TT突變純合型可能為不明原因復發(fā)性流產(chǎn)的危險因素。安樂等[10]在探討MTHFR基因多態(tài)性與先天性非綜合型唇腭裂的發(fā)生關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，單純性唇腭裂以及唇裂伴或者不伴腭裂組C677T位點的T等位基因頻率明顯高于正常對照人群。

本研究進一步分析了MTHFR的C677T和A1298C兩個位點的聯(lián)合基因型頻率分布，發(fā)現(xiàn)研究組CC/CC、CT/CC、TT/AC聯(lián)合基因型頻率顯著高于對照組，而CC/AA和CT/AA聯(lián)合基因型頻率顯著低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義。韋燕珍等[11]對柳州地區(qū)MTHFR基因多態(tài)性與不良妊娠結(jié)局的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，A1298C位點發(fā)生CC純合突變和C677T位點發(fā)生TT純合突變對不良妊娠結(jié)局的影響均顯著，當兩個位點均發(fā)生雜合突變時，對不良妊娠結(jié)局的影響不顯著。本研究除了TT/AA這個基因型，其余與韋燕珍等[11]研究結(jié)果一致。本文研究對象均生活在杭州，飲食差異較小，生活習慣相近，環(huán)境影響差異小，研究結(jié)果可信度較高。

綜上所述，有不良妊娠史的女性MTHFR基因C677T位點的TT突變純合型、A1298C位點的CC突變純合型頻率均顯著高于無不良妊娠史的婦女；而C677T位點的CC野生純合型、A1298C位點的AA野生純合型頻率均顯著低于無不良妊娠史的婦女，提示基因C677T和A1298C位點多態(tài)可能與不良妊娠結(jié)局有關(guān)。此外，兩組在C677T和A1298C兩個位點的聯(lián)合基因型CC/CC、CT/CC、TT/AC比較差異均有統(tǒng)計學意義，提示上述聯(lián)合基因型與不良妊娠結(jié)局密切相關(guān)。此類人群應進行葉酸代謝基因多態(tài)性檢測，并針對檢測結(jié)果做好相應的個性化干預措施。