周璐璐 朱雪潔 李如意 朱雪瓊

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advancedglycation end products，RAGE）是一種具有多配體的跨膜信號轉(zhuǎn)導受體[1]。研究發(fā)現(xiàn)RAGE在卵巢癌[2]、乳腺癌[3]、子宮內(nèi)膜癌[4]及結(jié)直腸癌[5]等腫瘤中的表達明顯上調(diào)，其異常表達被認為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RAGE蛋白在正常宮頸鱗狀上皮組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級以及宮頸鱗癌中的表達逐漸增高[6]。但是，RAGE對宮頸癌細胞生物學行為的影響及其機制尚未明確。因此，本研究通過轉(zhuǎn)染pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒構(gòu)建RAGE基因穩(wěn)定過表達的宮頸鱗癌SiHa細胞株，觀察RAGE表達改變對宮頸鱗癌SiHa細胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 SiHa細胞及人胚腎細胞293T細胞購于中國科學院上海細胞研究所細胞庫，DMEM培養(yǎng)基及FBS均購于美國Gibco公司。大腸桿菌菌株DH5α購于北京天根生物科技有限公司。RAGE抗體購于美國Santa-Crutz公司，增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、與 Bcl-2相互作用的細胞死亡調(diào)節(jié)因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）抗體均購于美國Cell Signaling Technology公司。慢病毒空載體pLenti-C-mGFP-vector及pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒均購于美國Origene公司。CCK-8試劑盒購于日本同仁化學研究所；PE/7-AAD購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將SiHa細胞及人胚腎細胞293T細胞加到改良DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱，每隔48h換液1次。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

1.2.2.1 pLenti-C-mGFP-RAGE過表達慢病毒的包裝、收集 人胚腎細胞293T細胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種于T75培養(yǎng)瓶，待細胞匯合度達60%～80%，用慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G以及目的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine3000說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6h后換液。轉(zhuǎn)染48h后觀察細胞狀態(tài)，并在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達情況并觀察轉(zhuǎn)染效率。用0.45μm的無菌聚偏氟乙烯（PVDF）針式過濾器過濾收集病毒液。

1.2.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及分組 將細胞進行分組培養(yǎng)，空白對照組為僅添加凝聚胺，空載體組為添加凝聚胺+轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒，過表達組為添加凝聚胺+轉(zhuǎn)染RAGE過表達質(zhì)粒。每個培養(yǎng)皿中加入5×105個SiHa細胞，培養(yǎng)24h，細胞匯合度約50%，用終濃度為8μg/ml凝聚胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞30min，再加入1ml病毒液感染細胞，24h后換液，48h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 Western blot法檢測 RAGE、PCNA、Bcl-2、Bax及Bim蛋白表達水平 分別提取各組細胞總蛋白，測定蛋白濃度。取40μg蛋白上樣，常規(guī)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉封閉2h后，分別加入 RAGE（1∶2 000）、PCNA（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bim（1∶1 000）及 GAPDH（1∶2 000）抗體，4℃孵育過夜，洗膜后分別加入辣根過氧化酶標記IgG抗體，室溫下孵育2h，洗膜后將顯影液加于PVDF膜上。用凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析。以目標蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值計算各組蛋白的相對表達量。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖情況 SiHa細胞用新鮮完全培養(yǎng)基重懸后，調(diào)整細胞密度為5×104/L，向96孔板加入細胞懸液100μl。置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加入CCK-8試劑10μl+DMEM 90μl，避光孵育2h。取出96孔板置于酶標儀上測定450nm處的吸光度（OD）值，每組實驗重復3次。1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化各組細胞，1 000r/min離心5min，移入流式管，用預冷的PBS洗2次。每管加入500μl 1×binding buffer懸浮細胞，使細胞密度約為 1×106/ml。向流式管中加入5μl PE/5μl 7-AAD，混勻后避光孵育15min。1h內(nèi)上流式細胞儀檢測結(jié)果，每組實驗重復3次。

1.2.6 裸鼠皮下成瘤 將過表達組及空載體組SiHa細胞按5×106/只接種在裸鼠背部右側(cè)腋下皮下。待細胞成瘤后，每隔4d測量皮下移植瘤體積，觀察移植瘤生長情況，8周后處死裸鼠，稱量瘤體質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒后SiHa細胞中RAGE蛋白表達水平 Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，過表達組可檢測GFP-RAGE融合蛋白，表明pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入SiHa細胞中，RAGE蛋白表達水平約為空載體組的（2.13±0.57）倍，見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒后SiHa細胞中RAGE蛋白表達的電泳圖

2.2 RAGE蛋白表達增高對SiHa細胞增殖的影響 CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，過表達組SiHa細胞的增殖力均明顯高于空白對照組及空載體組（均P＜0.05），空白對照組及空載體組SiHa細胞的增殖力比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示RAGE蛋白表達上調(diào)后促進了SiHa細胞的增殖，見表1。

表1 RAGE蛋白表達增高對SiHa細胞增殖的影響

2.3 RAGE蛋白表達增高對SiHa細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，過表達組SiHa細胞的凋亡率為（7.10±2.67）%，明顯低于空白對照組的（18.33±2.06）%及空載體組的（19.81±2.49）%（均P＜0.05），空白對照組及空載體組SiHa細胞的凋亡率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示RAGE上調(diào)后抑制了SiHa細胞的凋亡，見圖2。

圖2 3組SiHa細胞的流式細胞圖

2.4 RAGE蛋白表達增高對SiHa細胞中增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 Western blot法檢測發(fā)現(xiàn)，過表達組PCNA及Bcl-2蛋白表達水平均明顯高于空白對照組及空載體組（均P＜0.05），而Bax/Bcl-2表達水平低于均明顯低于空白對照組及空載體組（均P＜0.05），3組Bax及Bim蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2及圖3。

2.5 RAGE蛋白表達增高對裸鼠宮頸癌皮下成瘤的影響 過表達組裸鼠皮下瘤體體積為（1 599.47±247.97）mm3，瘤體質(zhì)量為（1.67±0.35）g，顯著高于空載體組的體 積（629.92±140.59）mm3和瘤體質(zhì)量（0.74±0.42）g，差異

表2 RAGE蛋白表達增高對SiHa細胞中增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖4-5。

圖3 RAGE蛋白表達增高后SiHa細胞中增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達的電泳圖

圖4 不同RAGE蛋白表達2組裸鼠宮頸皮下瘤體體積的比較（a：空載體組瘤體圖；b：過表達組瘤體圖）

圖5 不同RAGE蛋白表達2組裸鼠宮頸皮下瘤體體積的比較（與空載體組比較，*P＜0.05）

3 討論

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，最新數(shù)據(jù)顯示，2017年全美宮頸癌新發(fā)病例高達12 820例，死亡病例達4 210例[7]。Chang等[8]研究表明宮頸癌患病呈現(xiàn)年輕化趨勢，宮頸癌和癌前病變的發(fā)病率呈上升趨勢，但宮頸癌的具體發(fā)生、發(fā)展機制尚未明確。

RAGE蛋白是細胞表面分子免疫球蛋白超家族成員之一，可與晚期糖基化終末產(chǎn)物、高遷移率蛋白B1、溶血性磷脂酸、S-100/鈣粒蛋白和β淀粉樣肽等配體相互作用，激活細胞內(nèi)相關(guān)信號通路，導致炎癥和癌癥的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。Iotzova-Weiss等[11]利用慢病毒包裹的RAGE特異shRNA轉(zhuǎn)染原代角質(zhì)細胞降低RAGE基因的表達量，發(fā)現(xiàn)RAGE基因低表達組的細胞生長速率較陰性對照組下降了80%，提示RAGE基因水平下調(diào)后可抑制角質(zhì)細胞的增殖能力，表明了RAGE基因與鱗狀上皮細胞的增殖相關(guān)。Jin等[12]通過免疫共沉淀實驗驗證了S-100A14與RAGE在食管鱗癌細胞中相互結(jié)合并促進食管鱗癌細胞的增殖能力。Radia等[13]下調(diào)乳腺癌細胞中RAGE蛋白表達量后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65、細胞增殖標志物PCNA和G1/S-特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1）的表達量也都隨之下降，說明RAGE對乳腺癌細胞的增殖具有一定的促進作用。但關(guān)于RAGE對宮頸鱗癌細胞生物學行為影響的研究尚未見報道。

本研究應用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，使SiHa細胞中RAGE蛋白穩(wěn)定過表達后，發(fā)現(xiàn)過表達組SiHa細胞的增殖能力較空白對照組顯著升高，并檢測到增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達量升高，提示RAGE基因可促進宮頸鱗癌細胞增殖。同時，裸鼠皮下成瘤實驗也發(fā)現(xiàn)RAGE基因具有促進宮頸鱗癌腫瘤生長的能力。

Lata等[14]利用17α乙炔基雌二醇作用乳腺癌細胞系MCF-7后，提高了細胞內(nèi)雌激素受體相關(guān)受體γ的表達，隨后增強了細胞的氧化應激，激活了轉(zhuǎn)錄因子和NF-κB，最終導致了RAGE蛋白表達明顯增高。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RAGE基因可激活細胞周期蛋白Cyclin D1的表達而促進細胞的增殖，同時RAGE基因可促進Akt磷酸化及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，不僅參與了細胞的增殖，也參與了抑制細胞的凋亡。Malik等[15]也曾提出RAGE基因可以通過激活細胞周期蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2及自噬相關(guān)蛋白的表達，抑制腫瘤細胞的凋亡，從而提高腫瘤細胞的存活率。本研究發(fā)現(xiàn)RAGE具有促進宮頸癌細胞凋亡的能力，且該作用與抗凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)，而與Bax和Bim無關(guān)。