周璐璐 朱雪潔 李如意 朱雪瓊

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advancedglycation end products，RAGE）是一種具有多配體的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體[1]。研究發(fā)現(xiàn)RAGE在卵巢癌[2]、乳腺癌[3]、子宮內(nèi)膜癌[4]及結(jié)直腸癌[5]等腫瘤中的表達(dá)明顯上調(diào)，其異常表達(dá)被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)RAGE蛋白在正常宮頸鱗狀上皮組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)以及宮頸鱗癌中的表達(dá)逐漸增高[6]。但是，RAGE對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制尚未明確。因此，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒構(gòu)建RAGE基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞株，觀察RAGE表達(dá)改變對(duì)宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡及裸鼠成瘤能力的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 SiHa細(xì)胞及人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)，DMEM培養(yǎng)基及FBS均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)于北京天根生物科技有限公司。RAGE抗體購(gòu)于美國(guó)Santa-Crutz公司，增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān) X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、與 Bcl-2相互作用的細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)因子（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。慢病毒空載體pLenti-C-mGFP-vector及pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒均購(gòu)于美國(guó)Origene公司。CCK-8試劑盒購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所；PE/7-AAD購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SiHa細(xì)胞及人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞加到改良DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，每隔48h換液1次。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

1.2.2.1 pLenti-C-mGFP-RAGE過(guò)表達(dá)慢病毒的包裝、收集 人胚腎細(xì)胞293T細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，接種于T75培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞匯合度達(dá)60%～80%，用慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G以及目的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine3000說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染6h后換液。轉(zhuǎn)染48h后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達(dá)情況并觀察轉(zhuǎn)染效率。用0.45μm的無(wú)菌聚偏氟乙烯（PVDF）針式過(guò)濾器過(guò)濾收集病毒液。

1.2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)，空白對(duì)照組為僅添加凝聚胺，空載體組為添加凝聚胺+轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒，過(guò)表達(dá)組為添加凝聚胺+轉(zhuǎn)染RAGE過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。每個(gè)培養(yǎng)皿中加入5×105個(gè)SiHa細(xì)胞，培養(yǎng)24h，細(xì)胞匯合度約50%，用終濃度為8μg/ml凝聚胺的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞30min，再加入1ml病毒液感染細(xì)胞，24h后換液，48h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 Western blot法檢測(cè) RAGE、PCNA、Bcl-2、Bax及Bim蛋白表達(dá)水平 分別提取各組細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。取40μg蛋白上樣，常規(guī)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。用5%脫脂奶粉封閉2h后，分別加入 RAGE（1∶2 000）、PCNA（1∶2 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bim（1∶1 000）及 GAPDH（1∶2 000）抗體，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后分別加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記IgG抗體，室溫下孵育2h，洗膜后將顯影液加于PVDF膜上。用凝膠成像系統(tǒng)掃描并分析。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度比值計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 SiHa細(xì)胞用新鮮完全培養(yǎng)基重懸后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/L，向96孔板加入細(xì)胞懸液100μl。置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加入CCK-8試劑10μl+DMEM 90μl，避光孵育2h。取出96孔板置于酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度（OD）值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化各組細(xì)胞，1 000r/min離心5min，移入流式管，用預(yù)冷的PBS洗2次。每管加入500μl 1×binding buffer懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞密度約為 1×106/ml。向流式管中加入5μl PE/5μl 7-AAD，混勻后避光孵育15min。1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 裸鼠皮下成瘤 將過(guò)表達(dá)組及空載體組SiHa細(xì)胞按5×106/只接種在裸鼠背部右側(cè)腋下皮下。待細(xì)胞成瘤后，每隔4d測(cè)量皮下移植瘤體積，觀察移植瘤生長(zhǎng)情況，8周后處死裸鼠，稱量瘤體質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒后SiHa細(xì)胞中RAGE蛋白表達(dá)水平 Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)組可檢測(cè)GFP-RAGE融合蛋白，表明pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入SiHa細(xì)胞中，RAGE蛋白表達(dá)水平約為空載體組的（2.13±0.57）倍，見(jiàn)圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染pLenti-C-mGFP-RAGE質(zhì)粒后SiHa細(xì)胞中RAGE蛋白表達(dá)的電泳圖

2.2 RAGE蛋白表達(dá)增高對(duì)SiHa細(xì)胞增殖的影響 CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)組SiHa細(xì)胞的增殖力均明顯高于空白對(duì)照組及空載體組（均P＜0.05），空白對(duì)照組及空載體組SiHa細(xì)胞的增殖力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示RAGE蛋白表達(dá)上調(diào)后促進(jìn)了SiHa細(xì)胞的增殖，見(jiàn)表1。

表1 RAGE蛋白表達(dá)增高對(duì)SiHa細(xì)胞增殖的影響

2.3 RAGE蛋白表達(dá)增高對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)組SiHa細(xì)胞的凋亡率為（7.10±2.67）%，明顯低于空白對(duì)照組的（18.33±2.06）%及空載體組的（19.81±2.49）%（均P＜0.05），空白對(duì)照組及空載體組SiHa細(xì)胞的凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示RAGE上調(diào)后抑制了SiHa細(xì)胞的凋亡，見(jiàn)圖2。

圖2 3組SiHa細(xì)胞的流式細(xì)胞圖

2.4 RAGE蛋白表達(dá)增高對(duì)SiHa細(xì)胞中增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 Western blot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)組PCNA及Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯高于空白對(duì)照組及空載體組（均P＜0.05），而Bax/Bcl-2表達(dá)水平低于均明顯低于空白對(duì)照組及空載體組（均P＜0.05），3組Bax及Bim蛋白表達(dá)水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表2及圖3。

2.5 RAGE蛋白表達(dá)增高對(duì)裸鼠宮頸癌皮下成瘤的影響 過(guò)表達(dá)組裸鼠皮下瘤體體積為（1 599.47±247.97）mm3，瘤體質(zhì)量為（1.67±0.35）g，顯著高于空載體組的體 積（629.92±140.59）mm3和瘤體質(zhì)量（0.74±0.42）g，差異

表2 RAGE蛋白表達(dá)增高對(duì)SiHa細(xì)胞中增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖4-5。

圖3 RAGE蛋白表達(dá)增高后SiHa細(xì)胞中增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

圖4 不同RAGE蛋白表達(dá)2組裸鼠宮頸皮下瘤體體積的比較（a：空載體組瘤體圖；b：過(guò)表達(dá)組瘤體圖）

圖5 不同RAGE蛋白表達(dá)2組裸鼠宮頸皮下瘤體體積的比較（與空載體組比較，*P＜0.05）

3 討論

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，最新數(shù)據(jù)顯示，2017年全美宮頸癌新發(fā)病例高達(dá)12 820例，死亡病例達(dá)4 210例[7]。Chang等[8]研究表明宮頸癌患病呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)，宮頸癌和癌前病變的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但宮頸癌的具體發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未明確。

RAGE蛋白是細(xì)胞表面分子免疫球蛋白超家族成員之一，可與晚期糖基化終末產(chǎn)物、高遷移率蛋白B1、溶血性磷脂酸、S-100/鈣粒蛋白和β淀粉樣肽等配體相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致炎癥和癌癥的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。Iotzova-Weiss等[11]利用慢病毒包裹的RAGE特異shRNA轉(zhuǎn)染原代角質(zhì)細(xì)胞降低RAGE基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)RAGE基因低表達(dá)組的細(xì)胞生長(zhǎng)速率較陰性對(duì)照組下降了80%，提示RAGE基因水平下調(diào)后可抑制角質(zhì)細(xì)胞的增殖能力，表明了RAGE基因與鱗狀上皮細(xì)胞的增殖相關(guān)。Jin等[12]通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了S-100A14與RAGE在食管鱗癌細(xì)胞中相互結(jié)合并促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的增殖能力。Radia等[13]下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中RAGE蛋白表達(dá)量后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65、細(xì)胞增殖標(biāo)志物PCNA和G1/S-特異性周期蛋白-D1（Cyclin D1）的表達(dá)量也都隨之下降，說(shuō)明RAGE對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用。但關(guān)于RAGE對(duì)宮頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究應(yīng)用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，使SiHa細(xì)胞中RAGE蛋白穩(wěn)定過(guò)表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)組SiHa細(xì)胞的增殖能力較空白對(duì)照組顯著升高，并檢測(cè)到增殖相關(guān)蛋白PCNA的表達(dá)量升高，提示RAGE基因可促進(jìn)宮頸鱗癌細(xì)胞增殖。同時(shí)，裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)RAGE基因具有促進(jìn)宮頸鱗癌腫瘤生長(zhǎng)的能力。

Lata等[14]利用17α乙炔基雌二醇作用乳腺癌細(xì)胞系MCF-7后，提高了細(xì)胞內(nèi)雌激素受體相關(guān)受體γ的表達(dá)，隨后增強(qiáng)了細(xì)胞的氧化應(yīng)激，激活了轉(zhuǎn)錄因子和NF-κB，最終導(dǎo)致了RAGE蛋白表達(dá)明顯增高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RAGE基因可激活細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞的增殖，同時(shí)RAGE基因可促進(jìn)Akt磷酸化及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，不僅參與了細(xì)胞的增殖，也參與了抑制細(xì)胞的凋亡。Malik等[15]也曾提出RAGE基因可以通過(guò)激活細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1、抗凋亡蛋白Bcl-2及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而提高腫瘤細(xì)胞的存活率。本研究發(fā)現(xiàn)RAGE具有促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡的能力，且該作用與抗凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)，而與Bax和Bim無(wú)關(guān)。