曹學(xué)全 胡金蒙 楊朝暉 盧洪勝 魏科娜 章輝 顧華敏

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌居第2位，死亡率居第4位[1-2]。宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素、多種基因的聯(lián)合作用有關(guān)，其預(yù)后受多種因素影響，治療效果并不十分理想[3]。因此，尋找宮頸癌的特異性治療靶點具有重要臨床意義。磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白4（phosphatidylethanolamine binding protein 4，PEBP4）屬于PEBP家族的一個新成員，在細(xì)胞膜合成、成肌細(xì)胞分化、神經(jīng)發(fā)育和腫瘤發(fā)生等生物學(xué)過程中起重要作用[4]。有研究證實PEBP4表達上調(diào)與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及耐藥相關(guān)[5-6]。PEBP4過表達可增加肺癌細(xì)胞中蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）和雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的磷酸化水平。磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide3kinase，PI3K）/Akt/mTOR信號軸可能是PEBP4促進非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖和侵襲的關(guān)鍵分子途徑[7]。本研究應(yīng)用實時熒光定量PCR法及免疫組化En Vision法分別檢測48例宮頸癌和48例正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA和蛋白的表達差異，分析其表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系及宮頸癌組織中PEBP4和mTOR表達的相關(guān)性，初步從基因及蛋白水平探討其在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2008年6月至2013年12月在本院手術(shù)切除的宮頸癌標(biāo)本48例，患者術(shù)前均未接受化療、放療及免疫治療等，年齡 28～73（48.0±11.0）歲。參照 WHO宮頸癌組織學(xué)分類（2003）進行組織學(xué)分化程度的判斷。選取同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的正常宮頸組織標(biāo)本 48 例作為對照，患者年齡 32～61（44.5±6.7）歲。每例標(biāo)本的1/2在離體后20min內(nèi)放入-80℃低溫冰箱保存，用于實時熒光定量PCR檢測；另1/2以10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，用于免疫組化檢測。

1.2 主要試劑 Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司，PIPA裂解液、cDNA試劑盒、SYBR Green熒光染料均購于溫州長豐生物科技公司。PEBP4山羊抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司，mTOR兔抗人單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，En Vision通用試劑盒及DAB均購自廣州基因公司。

1.3 實時熒光定量PCR法檢測PEBP4和mTOR mRNA表達水平 設(shè)計PEBP4和mTOR基因PCR引物序列，具體如下：PEBP4 正 向 ：5′-ACTGGGTCTCATGATGGTGG-3′，反向：5′-CTCCATCCAGGAGGTGATCT-3′；mTOR 正向：5′-GCAGGAATAGCAAGAACTCG-3′，反向：5′-CCTCACAGCCACAGAAAGTAG-3′；內(nèi)參 GADPH正向：5′-GCTCACCATGGATGATGATATC-3′，反向：5′-GCCAGATTTTCTCCATGTCGTC-3′，所有引物均由溫州長豐生物科技公司合成。-80℃低溫冰箱保存的標(biāo)本，冰上操作，提取總RNA并檢測純度，然后轉(zhuǎn)染成cDNA反應(yīng)體系，37℃孵育60min。采用SYBR Green熒光染料，嚴(yán)格按照試劑盒說明書完成40個PCR循環(huán)。產(chǎn)生的熔解曲線和擴增曲線表明PCR擴增效率恒定，且已達到平臺期，引物特異性好且無引物二聚體產(chǎn)生。收集熒光信號進行結(jié)果分析。

表1 宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平比較

1.4 免疫組化檢測PEBP4和mTOR蛋白表達 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育10min，0.1mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高壓修復(fù)，3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30min，分別加入一抗（PEBP4、mTOR抗體濃度分別為1:200和1:100）4℃過夜，再加入二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片后光學(xué)顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性組織作陽性對照。PEBP4表達定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，mTOR表達定位于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒分布為陽性細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機選取5個高倍視野，觀察并記錄細(xì)胞染色強度：無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。記錄陽性細(xì)胞數(shù)百分比：陽性細(xì)胞數(shù)百分比≤25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為 3分，＞75%為4分。細(xì)胞染色強度與陽性細(xì)胞百分比計分的乘積為每例的最終積分。＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；等級資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表達的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平比較 宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平均明顯高于正常宮頸組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見表1。PEBP4、mTOR和GADPH的實時熒光定量PCR的熔解曲線和擴增曲線見圖1。

圖1 PEBP4、mTOR和GADPH的熔解曲線和擴增曲線（a：PEBP4熔解曲線；b：mTOR熔解曲線；c：GADPH熔解曲線；d：PEBP4擴增曲線；e：mTOR 擴增曲線；f：GADPH 擴增曲線）

2.2 PEBP4和mTOR mRNA表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 PEBP4 mRNA表達水平與宮頸癌浸潤肌層、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和臨床分期均有關(guān)（均P＜0.01），而與患者的年齡和分化程度均無關(guān)（均P＞0.05）。mTOR mRNA表達水平與宮頸癌患淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和臨床分期均有關(guān)（均P＜0.01），而與患者的年齡、分化程度和浸潤肌層均無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

表2 PEBP4和mTOR mRNA表達與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 宮頸癌組織和正常宮頸組織中PEBP4和mTOR蛋白表達比較 PEBP4和mTOR蛋白在宮頸癌組織中呈強表達，而在正常宮頸組織中呈弱表達或陰性表達，見圖2（插頁）。宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達的陽性率分別為 72.92%（35/48）和 66.67%（32/48），明顯高于正常宮頸組織的 10.42%（5/48）和 8.33%（4/48），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=38.571和34.844，均P＜0.01）。

2.4 PEBP4和mTOR蛋白表達陽性率與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系 PEBP4蛋白表達陽性率與宮頸癌浸潤肌層、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和臨床分期均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者的年齡和宮頸癌分化程度均無關(guān)（均P＞0.05）。mTOR蛋白表達陽性率與宮頸癌淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移和臨床分期均有關(guān)（均P＜0.05），而與患者的年齡、宮頸癌分化程度和浸潤肌層均無關(guān)（均P＞0.05），見表3。

表3 PEBP4和mTOR蛋白表達陽性率與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.5 宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白表達的相關(guān)性 Spearman等級相關(guān)分析顯示，48例宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平呈正相關(guān)（r=0.645，P=0.000）。48例宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達均陽性30例，均陰性11例，宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白陽性表達呈正相關(guān)（r=0.663，P=0.000），見表4。

表4 宮頸癌組織中PEBP4和mTOR蛋白表達的相關(guān)性（例）

3 討論

PEBP家族是由一類具有與磷脂酰乙醇胺結(jié)合能力的堿性蛋白所組成，廣泛表達于多種植物和動物。PEBP4是PEBP家族的一個新成員，該家族成員都有類似的結(jié)構(gòu)域[8]。PEBP4在肌肉組織中有表達，在成肌細(xì)胞分化期間，PEBP4和Raff/MEK信號通路之間可相互調(diào)控。干擾PEBP4的表達可抑制成肌細(xì)胞分化，可能與Raff/MEK信號通路的激活有關(guān)。此外，PEBP4過表達引起Akt激活，同時抑制ERK/JNK的活性[7]。有研究表明PEBP4在多種腫瘤標(biāo)本中的表達均增加，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)，說明PEBP4在腫瘤的進展過程中起著重要的作用[6-7,9]。Huang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，與低級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織比較，高級別膠質(zhì)瘤PEBP4表達明顯升高。多因素Cox回歸分析顯示PEBP4表達升高是膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨立因素。PEBP4低表達的患者較那些PEBP4高表達的患者有更長的生存時間。這些數(shù)據(jù)表明，PEBP4作為預(yù)測神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者腫瘤的分級和預(yù)后具有一定的臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中PEBP4 mRNA表達水平和蛋白表達陽性率均明顯高于正常宮頸組織，與Wu等[11]在胃癌中的研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)隨著臨床分期進展、浸潤肌層加深和淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，PEBP4 mRNA和蛋白表達逐漸升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。表明PEBP4 mRNA和蛋白高表達者，宮頸癌臨床分期較高，較容易發(fā)生侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Wu等[11]研究發(fā)現(xiàn)，沉默PEBP4的表達對胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移有明顯的抑制作用。此外，PEBP4過表達可通過激活PI3K/Akt信號通路，促進胃癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展和侵襲[11]。

mTOR是重要的絲氨酸/蘇氨酸蠶白激酶之一，是PI3K/Akt/mTOR信號通路的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。PI3K/Akt/mTOR通路是最重要的細(xì)胞內(nèi)信號通路之一。通過影響其下游多個效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化和代謝等一系列關(guān)鍵生理活動[12]。近年來，在多種惡性腫瘤中已發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt/mTOR途徑的異?；罨?，同時，該途徑的激活也可能在腫瘤細(xì)胞過度增殖和阻斷細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[13-14]。本研究顯示，mTOR mRNA和蛋白在正常宮頸組織均低表達，而在宮頸癌組織中表達明顯升高，并且隨著宮頸癌臨床分期進展和淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，表達水平進一步提高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。提示mTOR mRNA和蛋白高表達與宮頸癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且患者臨床分期高，預(yù)后差。

Yu等[7]報道，PEBP4的過表達促進Akt和mTOR的磷酸化，而沉默PEBP4的表達可抑制Akt和mTOR的磷酸化。因此，PEBP4可以通過PI3K/Akt/mTOR途徑對肺癌細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)作用。本研究中Spearman等級相關(guān)分析顯示，PEBP4和mTOR mRNA表達水平和蛋白陽性表達均呈正相關(guān)。提示PEBP4過表達可能通過激活PI3K/Akt/mTOR通路，導(dǎo)致mTOR mRNA和蛋白表達升高，進而促進宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究宮頸癌組織中PEBP4、mTOR mRNA和蛋白的表達明顯升高，且均與宮頸癌的臨床分期和轉(zhuǎn)移有關(guān)，PEBP4在浸潤肌層有意義，而mTOR無明顯意義，可能與本研究標(biāo)本量較少有關(guān)。宮頸癌組織中PEBP4和mTOR mRNA表達水平和蛋白陽性表達均呈正相關(guān)，提示兩者可能在同一信號通路中起調(diào)控作用。本研究為下一步采用RNA干擾和細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)探討沉默PEBP4表達是否能夠抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力及調(diào)控的具體機制如何提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)，PEBP4有望成為宮頸癌特異性治療的新靶點。