金平 潘永明 潘智勇 徐劍欽 林敏 佟雅涵 陳民利 許茂盛

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種起病隱匿的神經(jīng)退行性疾病，其臨床特征是進(jìn)行性的記憶力減退和認(rèn)知功能障礙，患者最終多因并發(fā)癥死亡[1]。β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）異常聚集和沉積所形成的老年斑是AD的主要病理特征，其中Aβ1-42是形成老年斑的主要成分，在AD發(fā)病機(jī)制中占有重要的作用[2]。報(bào)道顯示到本世紀(jì)中期，全球老年癡呆患者的數(shù)量將過億[3]。但是目前為止，AD的病因尚未完全闡明。相對于少見的家族性和早顯性AD，臨床上多見的晚發(fā)性AD發(fā)病機(jī)制更加復(fù)雜多樣[4]，研究顯示膽固醇代謝在晚發(fā)性AD發(fā)病中發(fā)揮了重要作用[5]。同時(shí)有研究認(rèn)為AD是一種由腦缺血所觸發(fā)的神經(jīng)變性疾病[6]。長期的低血流灌注可以造成腦組織能量供給障礙，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)而引起損傷，并最終導(dǎo)致進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙[7]。本研究旨在探討高膽固醇飲食對大白兔腦血流量（cerebral blood flow，CBF）和腦組織Aβ1-42水平的影響，并分析血清TC、CBF及Aβ1-42水平的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 普通級3～4月齡雄性日本大耳白兔12只，體質(zhì)量2.5～3.0kg，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級兔實(shí)驗(yàn)室[SYXK（浙）2013-0164]提供并飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度：18～22℃，相對濕度：40%～60%，12h/12h明暗交替。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為高膽固醇組和常規(guī)飲食組各6只，高膽固醇組以2%膽固醇飲食喂養(yǎng)，常規(guī)飲食組以常規(guī)基礎(chǔ)飲食喂養(yǎng)，12周后行血液檢測和MRI分析。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)學(xué)的3R原則。

1.2 兔血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平檢測 抽取兔耳緣靜脈血，采用日立7020全自動(dòng)生化分析儀和試劑盒（上海德賽診斷技術(shù)有限公司）檢測血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平。

1.3 兔腦CBF檢測 采用Discovery MR750 3.0T磁共振成像系統(tǒng)（美國GE公司），配備兔腦專用線圈（上海晨光公司）。主要MR掃描序列包括：軸位3DT1BRAVO、T2WI和動(dòng)脈自旋標(biāo)記（3D-ASL）。3D-ASL序列標(biāo)記后延遲時(shí)間1 525ms，其他主要序列及掃描參數(shù)見表1。

實(shí)驗(yàn)兔禁食不禁水12h后，經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg麻醉，待麻醉穩(wěn)定后，將實(shí)驗(yàn)兔以臥位固定并將頭頸部放入動(dòng)物專用線圈位置中，確保兔保持呼吸順暢和心跳平穩(wěn)。掃描完成后，將3D-ASL

原始數(shù)據(jù)傳輸至Sun Workstation ADW 4.2（美國GE公司），采用工作站自帶軟件Functool對ASL原始數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像矯正等預(yù)處理，獲得CBF參數(shù)圖，在雙側(cè)皮質(zhì)及海馬設(shè)置4個(gè)感興趣區(qū)，測得CBF平均值，記錄數(shù)據(jù)。由2位MR醫(yī)師單獨(dú)進(jìn)行圖像后處理，圖像中紅色代表高灌注，藍(lán)色代表低灌注。

1.4 兔腦皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平測定 經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液30mg/kg麻醉后處死并取腦，分離皮質(zhì)和海馬。使用IKA ULTRA-TURRAX勻漿機(jī)（德國希而科有限公司）將腦皮質(zhì)和海馬制備成10%的腦組織勻漿，4℃離心，4 500r/min離心10min，取上清液進(jìn)行檢測。使用ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）測定Aβ1-42含量，嚴(yán)格按照說明書操作。采用考馬斯亮藍(lán)法測定腦組織總蛋白質(zhì)量[8]。Aβ1-42水平以Aβ1-42含量/腦組織總蛋白質(zhì)量表示，單位為pg/mg。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；血清TC、CBF與Aβ1-42水平的相關(guān)性分析采用Person相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組兔血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較 高膽固醇組兔血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平均明顯高于常規(guī)飲食組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表 2。

表1 MR掃描序列主要成像參數(shù)

表2 兩組兔血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較（mmol/L）

2.2 兩組兔腦皮質(zhì)、海馬CBF比較 CBF參數(shù)圖顯示高膽固醇組兔腦皮質(zhì)、海馬血流灌注低于常規(guī)飲食組，見圖1（插頁）。高膽固醇組兔腦皮質(zhì)、海馬CBF分別為（16.94±4.35）和（12.53±3.90）ml/（min·100g），均明顯低于常規(guī)飲食組的（25.56±6.58）和（20.26±5.72）ml/（min·100g），兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

2.3 兩組兔腦皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平比較 高膽固醇

圖2 兩組兔腦皮質(zhì)、海馬CBF比較（a：兩組兔腦皮質(zhì)CBF比較；b：兩組兔腦海馬CBF比較；與常規(guī)飲食組比較，*P＜0.05）

2.4 兔血清TC、CBF和Aβ1-42水平的相關(guān)性分析 血清TC與皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平均呈正相關(guān)（r=0.774和0.649，均P＜0.05），見圖4a-b；血清TC 與皮質(zhì)、海馬 CBF組兔腦皮質(zhì)、海馬 Aβ1-42水平分別為（149.56±24.26）和（216.58±50.44）pg/mg，均明顯高于常規(guī)飲食組的（132.40±13.75）和（151.30±23.76）pg/mg，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.845 和-0.783，均P＜0.01），見圖 4c-d；皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平與CBF均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.637和-0.602，均P＜0.05），見圖 4e-f。

圖3 兩組兔腦皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平比較（a：兩組兔腦皮質(zhì)Aβ1-42水平比較；b：兩組兔腦海馬Aβ1-42水平比較；與常規(guī)飲食組比較，*P＜0.05）

圖4 兔血清TC、CBF與Aβ1-42水平的相關(guān)性分析

3 討論

Aβ的異常聚集和沉積是AD發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[5，9]。在正常的生理狀態(tài)下，Aβ的產(chǎn)生和降解處于動(dòng)態(tài)的平衡之中，當(dāng)體內(nèi)外的某些因素打破這個(gè)動(dòng)態(tài)的平衡，β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）的代謝便會(huì)出現(xiàn)異常，引起Aβ的生成增多和（或）降解減少，最終導(dǎo)致Aβ在腦內(nèi)的大量沉積。

目前研究認(rèn)為膽固醇代謝紊亂在AD的發(fā)病中扮演著重要角色[10]。膽固醇參與Aβ產(chǎn)生、聚集沉積及降解，高膽固醇血癥可增加大腦中Aβ的沉積，并損害學(xué)習(xí)和記憶功能[11]。根據(jù)Smith[12]的假說，AD的發(fā)病始于海馬，隨著疾病進(jìn)展，海馬內(nèi)神經(jīng)元的減少導(dǎo)致其所投射的其他神經(jīng)皮層內(nèi)神經(jīng)元代謝減緩、逐漸死亡。腦皮質(zhì)尤其是海馬的萎縮是AD患者在MRI上的特征性改變[13]。所以本課題組在成功獲得兔高膽固醇模型后，選取兔腦皮質(zhì)、海馬進(jìn)行Aβ1-42水平檢查，結(jié)果顯示兩組兔血清TC與皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平均呈正相關(guān)，且高膽固醇組兔腦皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平均明顯高于常規(guī)飲食組，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示高膽固醇血癥能促進(jìn)Aβ在腦內(nèi)的沉積，這與目前研究結(jié)論相符[14-15]。血清TC水平的升高可能通過改變細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)TC的分布影響APP在細(xì)胞膜中的定位，從而增強(qiáng)β-分泌酶和γ-分泌酶的活性，使Aβ的產(chǎn)生增多；同時(shí)TC也可以抑制α-分泌酶的活性，間接使Aβ的產(chǎn)生增加[16-17]。此外TC可以通過調(diào)節(jié)包括胰島素降解酶（insulin degradation enzyme，IDE）等諸多參與 Aβ 降解的一系列酶的表達(dá)和活性促進(jìn)Aβ的沉積。IDE是一種主要表達(dá)于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的鋅金屬肽鏈內(nèi)斷酶，對胞外的Aβ降解具有重要作用，其部分亞基存在于脂筏微域中，細(xì)胞膜TC水平升高可直接影響IDE的功能，導(dǎo)致Aβ降解減少[18]。

血清TC水平升高可引起血管內(nèi)皮損傷，從而導(dǎo)致內(nèi)皮脫落，組織因子釋放，激活體內(nèi)凝血系統(tǒng)，使體內(nèi)出現(xiàn)高凝狀態(tài)，導(dǎo)致血流緩慢，腦血流灌注減少[19]。本課題組利用MRI 3D-ASL序列檢測兔腦皮質(zhì)、海馬CBF，結(jié)果顯示高膽固醇組兔腦皮質(zhì)、海馬CBF均明顯低于常規(guī)飲食組，且兩組血清TC與皮質(zhì)、海馬CBF均呈負(fù)相關(guān)，與孫明等[19]研究結(jié)果相仿。

基于大鼠雙側(cè)頸動(dòng)脈結(jié)扎的慢性腦缺血模型研究顯示腦內(nèi)長期低灌注可使腦內(nèi)APP及Aβ水平明顯升高，可能與長期低血流灌注激活了APP基因并增強(qiáng)了β-分泌酶的活性有關(guān)[20-21]。異常沉積在周圍供血小動(dòng)脈及毛細(xì)血管基膜上的Aβ可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的內(nèi)皮素的收縮血管作用，引起腦血管收縮，加重腦的低血流灌注，導(dǎo)致Aβ進(jìn)一步沉積，從而形成惡性循環(huán)[22]。本研究結(jié)果也顯示兔腦皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平與CBF均呈負(fù)相關(guān)。此外當(dāng)腦內(nèi)出現(xiàn)低血流灌注時(shí)，腦內(nèi)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞均可出現(xiàn)明顯的增生和活化，引起免疫炎性反應(yīng)[23-24]，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[25]。AD的免疫炎性反應(yīng)機(jī)制同樣指出免疫炎性反應(yīng)參與AD的整個(gè)病理進(jìn)程：老年斑的形成過程中始終伴隨膠質(zhì)細(xì)胞的增生及炎性細(xì)胞因子過量產(chǎn)生[26]，表明慢性腦缺血可以通過免疫炎性反應(yīng)促進(jìn)AD的發(fā)生。

目前膽固醇異常代謝學(xué)說及慢性腦缺血觸發(fā)學(xué)說指出高膽固醇血癥及慢性腦缺血在AD的發(fā)病中起著重要作用。筆者之前通過高膽固醇飲食誘導(dǎo)的AD兔模型腦內(nèi)出現(xiàn)皮質(zhì)、海馬的萎縮和腦室擴(kuò)張等AD特征樣改變[27]，進(jìn)一步驗(yàn)證了AD的膽固醇異常代謝學(xué)說。根據(jù)文獻(xiàn)[12-13]，本研究選取并測量了兔腦皮質(zhì)、海馬CBF，結(jié)果顯示兔腦CBF明顯降低，兔腦皮質(zhì)、海馬Aβ1-42水平與CBF均呈負(fù)相關(guān)，筆者推測高膽固醇誘導(dǎo)AD的發(fā)生，不僅僅是基于其可以改變TC在神經(jīng)元膜、細(xì)胞內(nèi)的分布，或在強(qiáng)化APP淀粉樣途經(jīng)的同時(shí)抑制非淀粉樣途徑等作用，它還可以通過其引起的低血流灌注促進(jìn)腦內(nèi)Aβ的異常沉積。

綜上所述，高膽固醇飲食能引起腦海馬、皮質(zhì)CBF的減少和Aβ1-42水平的升高，繼發(fā)于高血脂的低血流灌注可能參與并促進(jìn)了Aβ1-42在腦內(nèi)的異常沉積。