蘇杰 盧建 黃高翔 胡新根 姜春婷 張寶燕

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）是體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，在軀體和心理應(yīng)激時均明顯升高。GCs主要通過糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）的介導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，包括免疫抑制、抗炎、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、胚胎發(fā)育和創(chuàng)傷修復(fù)等[1-2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)GCs還參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，地塞米松是人工合成的GCs，不僅可以作為化療方案的組成藥物直接抑制某些血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡；還可以作為實體腫瘤化療的重要輔助藥物，治療與實體腫瘤相關(guān)的某些合并癥及腫瘤治療相關(guān)不良反應(yīng)。胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，90%以上是起源于腺管上皮的胰腺導(dǎo)管腺癌[3]。其診斷和治療均十分困難，發(fā)現(xiàn)時大多已經(jīng)轉(zhuǎn)移，病死率非常高，5年生存率不足5%，中位生存期僅2～3個月，據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院報道其死亡率高

居惡性腫瘤第4位[4]。目前有關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌激素，尤其是GCs對胰腺癌增殖、黏附、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響了解不多，僅有的研究局限在GCs抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和增強化療藥物作用下腫瘤細(xì)胞存活等方面[5-6]。因此，闡明地塞米松對胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響具有重要的理論及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 小鼠胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02、人胰腺癌細(xì)胞株Mia-paca2購于美國ATCC細(xì)胞庫。

1.2 試劑和儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基購自中國基諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，規(guī)格250ml；PBS、二甲基亞砜（DMSO）、無水乙醇、甲醇購自上?；瘜W(xué)試劑有限公司，規(guī)格250ml；結(jié)晶紫購自上海生工生物有限公司，規(guī)格5g；地塞米松購自日本Sigma公司，規(guī)格5g；0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，規(guī)格500ml；FBS購自以色列BI公司，規(guī)格500ml。Transwell（3422）購自美國Corning公司；MatrigelTM細(xì)胞侵襲小室購自美國BD Biosciences公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 小鼠胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02、人胰腺癌細(xì)胞株Mia-paca2分別常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基和DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每周傳代2～3次。按實驗需求接種細(xì)胞于培養(yǎng)板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24h后棄去原培養(yǎng)液，預(yù)溫的PBS清洗細(xì)胞2～3遍以去除血清中激素對細(xì)胞的影響，將2株細(xì)胞分別分為地塞米松處理組和對照組，地塞米松處理組加入含10-7mol/L地塞米松的去激素血清培養(yǎng)液，對照組加入等體積含1‰無水乙醇的培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞增殖實驗 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)1 000～3 000個，培養(yǎng)箱中孵育過夜后給予相應(yīng)藥物處理不同時間（24、48、72h），棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO充分震蕩溶解細(xì)胞后，采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測其在570nm波長處的吸光度（OD）值。

1.5 細(xì)胞黏附實驗 細(xì)胞經(jīng)藥物預(yù)處理24h，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種8×104個/200μl細(xì)胞于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)45min后，PBS輕洗去除未貼壁細(xì)胞。每孔加入150μl DMSO充分震蕩溶解剩余貼壁細(xì)胞后，采用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測其在570nm波長處的OD值。

1.6 細(xì)胞劃痕實驗 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于12孔板（種板數(shù)以第2天細(xì)胞長滿為宜），培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；第2天用無菌的10μl槍頭于培養(yǎng)板孔底部均勻劃痕，PBS輕洗后拍照并標(biāo)記，按組別給予相應(yīng)藥物處理24h，于100倍鏡下觀察劃痕融合情況，固定視野拍照。并通過畫圖軟件測量24h時劃痕寬度及起始劃痕寬度，兩者比值得出劃痕愈合百分比（%），進(jìn)而體現(xiàn)細(xì)胞水平遷移能力。

1.7 細(xì)胞侵襲實驗

1.7.1 預(yù)平衡 于24孔板中加入800μl不含血清的培養(yǎng)液，將Transwell小室和侵襲小室置于24孔板內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱中平衡1h。

1.7.2 細(xì)胞處理 接種細(xì)胞于6孔板，經(jīng)過夜培養(yǎng)后，給予相應(yīng)藥物處理24h；細(xì)胞經(jīng)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液(兩組持續(xù)給予相應(yīng)藥物)，以每孔 4×104個細(xì)胞/200μl接種于預(yù)平衡處理過的Transwell小室和侵襲小室內(nèi)，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7.3 固定染色 24h后，吸去Transwell小室和侵襲小室中殘液，棉簽輕輕拭去上室側(cè)的細(xì)胞，后置于冰甲醇中固定10～15min，置于0.1%結(jié)晶紫染液中染色15～20min；PBS清洗后晾干，每孔隨機取5個視野于100倍鏡下計數(shù)并拍照。

2 結(jié)果

2.1 地塞米松對胰腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02和Mia-paca2的增殖能力隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增強，但地塞米松處理組在各個時間點（24、48、72h）與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖 1。

圖1 地塞米松對胰腺癌細(xì)胞Panc02和Mia-paca2增殖能力的影響

2.2 地塞米松對胰腺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力的影響 胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02和Mia-paca2經(jīng)10-7mol/L地塞米松處理24h后，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力較對照組細(xì)胞明顯增強，分別約為對照組的1.8倍和2倍（均P＜0.05），提示地塞米松能夠明顯增強胰腺癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，見圖2。

圖2 地塞米松對胰腺癌細(xì)胞Panc02和Mia-paca2黏附能力的影響（與對照組比較，*P＜0.05）

2.3 地塞米松對胰腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 經(jīng)10-7mol/L地塞米松處理24h后，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02和Mia-paca2的垂直遷移能力顯著增加，分別約為對照組的 8倍和 2.5倍（均P＜0.05）（圖 3a－b，見插頁）；進(jìn)一步采用細(xì)胞劃痕實驗觀察了地塞米松對胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02和Mia-paca2水平遷移的影響，發(fā)現(xiàn)地塞米松處理組胰腺癌細(xì)胞的水平遷移能力明顯增強（均P＜0.05）（圖3c-d，見插頁），提示地塞米松能夠明顯增強胰腺癌細(xì)胞的遷移能力。

2.4 地塞米松對胰腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 經(jīng)10-7mol/L地塞米松處理24h后，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc02和Mia-paca2的侵襲能力顯著增強，分別約為對照組的6倍和3.5倍（均P＜0.05），提示地塞米松能夠明顯增強胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力，見圖4（插頁）。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是個非常復(fù)雜的過程，除了致瘤因素導(dǎo)致的細(xì)胞多步驟多基因突變而產(chǎn)生的增殖、分化、凋亡、遷移等調(diào)控環(huán)節(jié)失常外，還受免疫系統(tǒng)、腫瘤微環(huán)境及體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌等多重因素的影響[7]。而作為體內(nèi)重要神經(jīng)內(nèi)分泌激素之一的GCs除了具有強大的抗炎和免疫抑制外，還能夠直接調(diào)控正?；驉鹤兗?xì)胞的增殖、分化及凋亡。以往研究表明，GCs對多種實體腫瘤均產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，如地塞米松能夠抑制非小細(xì)胞肺癌、肝癌等的增殖，能夠促進(jìn)乳腺癌、前列腺癌等在低血清或化療藥物作用下的存活[8-11]。盡管如此，GCs對胰腺癌的生物學(xué)效應(yīng)，特別是胰腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲還不清楚。

Benz等[5]發(fā)現(xiàn)GCs能夠抑制小鼠胰腺癌AR42j細(xì)胞的增殖。Norman等[6]研究也發(fā)現(xiàn)地塞米松能夠抑制人胰腺癌細(xì)胞的增殖，且該效應(yīng)是劑量依賴性的。而本實驗發(fā)現(xiàn)10-7mol/L地塞米松在處理72h內(nèi)未能明顯改變2株胰腺癌細(xì)胞的增殖，可能與地塞米松作用的時間較短，未發(fā)現(xiàn)明顯增殖抑制效果有關(guān)。本實驗還發(fā)現(xiàn)10-7mol/L地塞米松能明顯增強胰腺癌細(xì)胞與其細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力。由于腫瘤細(xì)胞與其細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力增強能夠激活整合素信號通路，通過激活PI3K/Akt通路促進(jìn)細(xì)胞的存活，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生化療藥物抵抗的機制之一[12-13]。本研究提示地塞米松能夠通過增強胰腺癌細(xì)胞的黏附能力，從而增加其對化療藥物的抵抗能力。

本實驗還研究了10-7mol/L地塞米松對2株不同胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲生物學(xué)行為的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)地塞米松能夠明顯增強胰腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，提示GCs對于胰腺癌細(xì)胞體內(nèi)的轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用，而該促進(jìn)作用與其促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞自身的遷移侵襲有關(guān)。另外，Piette等[14]研究顯示，在嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（SCID）小鼠的移植瘤模型中，地塞米松能抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。但也有報道在荷瘤裸鼠模型中地塞米松處理的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞肝臟轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目明顯增多[15]。由此看出，在不同的腫瘤細(xì)胞中地塞米松對其侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)作用體現(xiàn)出不一致性，提示GCs對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)作用具有腫瘤細(xì)胞特異性。GCs對機體的影響更是多方面的復(fù)雜過程，因此在整體實驗中證實GCs對于胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響更具有臨床意義。前期Egberts等[16]報道顯示，在SCID小鼠的移植瘤模型中，地塞米松能夠抑制胰腺細(xì)胞癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。該結(jié)果與本實驗結(jié)果不甚一致，由于采用此種小鼠的結(jié)果并不能真實說明GCs在整體中對胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和進(jìn)展的作用。因此，有必要采用更好的動物模型更深入的研究體內(nèi)GCs對胰腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，這也是筆者下一步實驗研究的重點。

機制方面，Békási等[17]研究發(fā)現(xiàn)在正常胰腺組織和胰腺癌中GR分布有明顯不同，這提示了GCs/GR信號通路調(diào)控的下游靶蛋白在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用。Huang等[18]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞骨架蛋白ROCK介導(dǎo)了GCs促進(jìn)黑色素瘤的體外遷移、侵襲和體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。另外，Hidalgo等[19]、Smith等[20]研究發(fā)現(xiàn)GCs還可影響腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)成分發(fā)揮促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)效應(yīng)。以上研究表明，GCs可以通過直接作用于腫瘤細(xì)胞來影響其遷移及侵襲，也可以影響腫瘤組織局部（微環(huán)境）調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)應(yīng)激或藥理劑量的GCs能夠明顯增強胰腺癌細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力，但對其增殖能力沒有明顯影響。該發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步闡明應(yīng)激狀況下GCs對胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用，從而進(jìn)一步認(rèn)識應(yīng)激激素與實體腫瘤的關(guān)系。