劉德亮 渠 昕△ 李惠林△ 趙恒俠 楚淑芳 莊偉坤 張學(xué)文

1深圳市中醫(yī)院，廣東深圳 5180332廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 5180333陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西咸陽 712046

流行病學(xué)調(diào)查[1-2]結(jié)果顯示，近年來我國肥胖、Ⅱ型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病率逐年增加，這與生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。行為學(xué)研究[3-4]發(fā)現(xiàn)人和動物對膳食脂肪均有較強(qiáng)的偏好。因此，若能調(diào)控?cái)z食行為，控制對膳食脂肪的偏好，減少脂肪攝入，可延緩代謝性疾病的發(fā)生和進(jìn)展[5]?；钛堤秋嬍潜驹簠f(xié)定處方，具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的作用；前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的降糖、調(diào)脂及抑制β細(xì)胞凋亡等作用。方中含有大量性味苦寒、甘寒的益氣養(yǎng)陰清熱藥物，按中醫(yī)理論而言，其有滋膩礙胃之嫌，但可能發(fā)揮對攝食行為的調(diào)控作用。因此，本文對活血降糖飲干預(yù)的肥胖大鼠的攝食行為進(jìn)行研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動物及飼養(yǎng)

SPF級雄性SD大鼠50只，體重180～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18～22℃，濕度40～70%，自由攝食、飲水，自然晝夜節(jié)律光照。常規(guī)飼料(熱量構(gòu)成為脂肪13%，蛋白質(zhì)23%，碳水化合物64%)及高脂飼料(熱量構(gòu)成為脂肪60%，蛋白質(zhì)20%，碳水化合物20%)均購于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 藥物及試劑

活血降糖飲(黃芪30 g，生地20 g，丹參30 g，太子參30 g，五味子15 g，麥冬15 g，山藥12 g，黃精15 g，丹皮12 g，大黃16 g，紅花12 g，桃仁10 g)蒸餾水浸泡2 h后，大火煎開，小火繼續(xù)煎煮30 min，共2次，過濾濃縮為4 g/ml藥液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20023370)用蒸餾水溶解為濃度20 mg/ml藥液，4℃儲存。

1.3 試劑及儀器

總膽固醇(TC)、總?cè)８视?TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、血糖試劑盒購于南京建成生物工程研究所，游離脂肪酸(NEFA)試劑盒購自日本和光純藥工業(yè)株式會社，胰島素放免試劑盒購于北京原子能科學(xué)研究所。兔抗大鼠CD36多克隆抗體、β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司，蛋白抽提試劑盒及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物公司。檢測儀器包括北京六一儀器廠DYCZ-24型垂直板電泳槽等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物模型和分組 經(jīng)過1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，隨機(jī)選出10只大鼠作為正常對照組，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。其余大鼠以高脂高熱卡飲食喂養(yǎng)8周后，篩選出30只血脂及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)異常的作為成模大鼠(根據(jù)以上指標(biāo)計(jì)算95%可信區(qū)間，數(shù)據(jù)均高于正常范圍上線20%認(rèn)為模型成功)，將其隨機(jī)分為模型組、中藥組、二甲雙胍組，每組10只。

1.4.2 動物處理 正常組和模型組以適量體積生理鹽水灌胃，中藥組以5 g/(kg·d)劑量灌服活血降糖飲，二甲雙胍組以200 mg/(kg·d)劑量灌胃二甲雙胍。正常組喂以常規(guī)飼料，其他組均繼續(xù)喂以高脂高熱卡飼料。各組干預(yù)8周后，進(jìn)行雙瓶喜好實(shí)驗(yàn)，檢測大鼠對膳食脂肪的偏好。1周后，禁食24 h，腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈采血，分離血清，檢測血脂、游離脂肪酸、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)；斷頭，取腦組織，冰上分離海馬組織，經(jīng)過液氮后保存于-80℃冰箱。

1.4.3 指標(biāo)測量 ①按照說明書檢測各血清學(xué)指標(biāo)；②雙瓶喜好實(shí)驗(yàn)：將標(biāo)號、稱重過的盛有純水和20%亞油酸(LA)的200 ml飲水瓶，分別插入鼠籠籠蓋左右兩端(LA水在左，純水在右)1 h，1 h后交換2瓶位置，再過1 h后將飲水瓶取下，稱重；脂肪偏好度=[2h 20%亞油酸飲用量/(2h 20%亞油酸飲用量+2h純水飲用量)]×100%；③western blot檢測海馬組織CD36蛋白表達(dá)：海馬組織總蛋白提取按照蛋白抽提試劑盒說明書操作，考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白濃度；10% SDS-PAGE凝膠電泳(各樣品上樣量均為50μg)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后，封閉2 h，一抗4℃孵育過夜(抗體工作濃度為1∶1000)，次日經(jīng)TBST洗膜后用二抗孵育2 h(二抗工作濃度為1∶5000)，進(jìn)行雜交ECL化學(xué)發(fā)光，分析各條帶的吸光度值，用蛋白/內(nèi)參的比值表示各蛋白的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 活血降糖飲對大鼠體重的影響

模型組大鼠體重明顯高于正常組，治療后，中藥組和二甲雙胍組大鼠體重明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠體重比較

與正常組比較**P<0.01；與模型組比較△△P<0.01

2.2 活血降糖飲對大鼠FPG、FINS以及HOMA-IR的影響

模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均明顯高于正常組；治療后，中藥組和二甲雙胍組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均較模型組有不同程度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠FPG、FINS及HOMA-IR比較

與正常組比較**P<0.01；與模型組比較△P<0.05，△△P<0.01

2.3 活血降糖飲對大鼠血脂水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠TC、TG、LDL-c、NEFA均明顯升高，HDL-c明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和二甲雙胍組TC、TG、LDL-c、NEFA均有不同程度下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而中藥組和二甲雙胍組HDL-c與模型組比較無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血脂比較

與正常組比較**P<0.01；與模型組比較△△P<0.01

2.4 活血降糖飲對大鼠脂肪偏好度的影響

與正常組比較，模型組大鼠脂肪偏好度明顯增加；與模型組比較，中藥組和二甲雙胍組脂肪偏好度明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠脂肪偏好度

與正常組比較**P<0.01；與模型組比較△△P<0.01

2.5 活血降糖飲對大鼠海馬組織CD36表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠海馬組織中CD36蛋白表達(dá)明顯增加；與模型組比較，中藥組和二甲雙胍組海馬組織中CD36蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

A：正常組；B：模型組；C：中藥組；D：二甲雙胍組與正常組比較**P<0.01；與模型組比較△△P<0.01圖1 各組大鼠海馬組織CD36蛋白表達(dá)

3 討論

攝食是人體維持生命的重要生理行為，過量攝取高脂高熱卡飲食會增加代謝性疾病的發(fā)生[6]。根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“未病先防，既病防變”的思想，可通過抑制對膳食脂肪的偏好控制高脂飲食的攝入量，從而預(yù)防代謝性疾病的發(fā)生和進(jìn)展。

傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為“胃氣”與人的健康關(guān)系密切，而食欲由“胃氣”決定。因此，注意顧護(hù)“胃氣”，也就增加了食欲。對“胃氣”的抑制，多出現(xiàn)在一些中藥的不良反應(yīng)中，比如滋陰藥，大多“滋膩礙胃”。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)中藥對食欲抑制有間接作用，比如Wang J等[7]學(xué)者證實(shí)了苦寒藥和滋陰藥有“礙胃”之嫌，在應(yīng)用黃連生脈飲(黃連、黃芪、黨參、麥冬、五味子、丹參、苦參、當(dāng)歸、酸棗仁)治療早搏的過程中，患者出現(xiàn)食欲減退。中醫(yī)多以“三消”理論指導(dǎo)治療糖尿病，主要以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主，常應(yīng)用滋膩礙胃的滋陰藥和苦寒藥。

本科室協(xié)定方活血降糖飲由黃芪、生地、丹參、太子參、黃精、五味子、麥冬、山藥、丹皮、紅花、桃仁、大黃等藥物組成，具有益氣養(yǎng)陰，清熱瀉濁，活血通絡(luò)的功效，臨床上用于治療Ⅱ型糖尿病，治療后患者多食易饑癥狀明顯改善。本研究結(jié)果表明，經(jīng)活血降糖飲治療后，肥胖大鼠脂肪偏好明顯降低，說明活血降糖飲對肥胖大鼠攝食行為中的飲食偏好具有調(diào)控作用。

CD36是一種完整的細(xì)胞膜糖蛋白，其在細(xì)胞表面和溶酶體內(nèi)部均有表達(dá)。CD36屬于B族清道夫受體家族的多功能蛋白，其在脊椎動物的多種細(xì)胞均有表達(dá)，如巨噬細(xì)胞、血小板、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等[8]。CD36同時具有識別、轉(zhuǎn)運(yùn)游離脂肪酸的多種功能。Laugerette F等[9]學(xué)者利用CD36基因敲除(CD36-/-)小鼠，通過雙瓶喜好實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，在排除了嗅覺和觸覺等影響因素后，CD36-/-小鼠對2%亞油酸的偏好顯著減弱，且不能區(qū)別富含亞油酸的溶液和對照溶液，而CD36-/-小鼠對甜味的喜好和對苦味的厭惡感仍然存在，其結(jié)果說明CD36對于脂類的識別起著重要作用。臨床研究[10]結(jié)果則表明，在肥胖人群中，CD36表達(dá)增加的個體與CD36表達(dá)減少的個體相比，身高體重指數(shù)較高，膳食脂肪的攝入也較多。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中關(guān)于CD36的研究較少，目前的研究發(fā)現(xiàn)CD36在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有多種功能，有研究[11]表明，CD36可能參與中性粒細(xì)胞吞噬作用的調(diào)控，有助于減輕缺血后的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，還有研究[12]發(fā)現(xiàn)CD36缺失可以延緩阿爾茨海默病認(rèn)知功能的惡化。同時，有研究[13]表明CD36參與脂質(zhì)感知，但是具體作用機(jī)制仍不明確。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，活血降糖飲具有良好的減重、調(diào)脂和減輕胰島素抵抗的作用，這與本課題組以往研究結(jié)果類似。同時本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗大鼠對膳食脂肪偏好明顯增加，其海馬組織中CD36蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)。經(jīng)中藥和二甲雙胍干預(yù)后，這種改變被糾正?；钛堤秋嬒抡{(diào)海馬組織CD36蛋白表達(dá)可能是其調(diào)控大鼠對膳食脂肪偏好的作用機(jī)制之一，但這兩者之間的關(guān)聯(lián)，以及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白表達(dá)的調(diào)控等具體作用機(jī)制，仍需進(jìn)一步研究。