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        活血降糖飲對肥胖大鼠攝食行為的調(diào)節(jié)作用及海馬CD36表達(dá)的影響*

        2018-09-18 12:04:04劉德亮李惠林趙恒俠楚淑芳莊偉坤張學(xué)文
        中西醫(yī)結(jié)合研究 2018年1期
        關(guān)鍵詞:降糖海馬活血

        劉德亮 渠 昕△ 李惠林△ 趙恒俠 楚淑芳 莊偉坤 張學(xué)文

        1深圳市中醫(yī)院,廣東深圳 5180332廣州中醫(yī)藥大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院,廣東深圳 5180333陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西咸陽 712046

        流行病學(xué)調(diào)查[1-2]結(jié)果顯示,近年來我國肥胖、Ⅱ型糖尿病等代謝性疾病的發(fā)病率逐年增加,這與生活水平的提高,飲食結(jié)構(gòu)的改變密切相關(guān)。行為學(xué)研究[3-4]發(fā)現(xiàn)人和動物對膳食脂肪均有較強(qiáng)的偏好。因此,若能調(diào)控攝食行為,控制對膳食脂肪的偏好,減少脂肪攝入,可延緩代謝性疾病的發(fā)生和進(jìn)展[5]?;钛堤秋嬍潜驹簠f(xié)定處方,具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)的作用;前期研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的降糖、調(diào)脂及抑制β細(xì)胞凋亡等作用。方中含有大量性味苦寒、甘寒的益氣養(yǎng)陰清熱藥物,按中醫(yī)理論而言,其有滋膩礙胃之嫌,但可能發(fā)揮對攝食行為的調(diào)控作用。因此,本文對活血降糖飲干預(yù)的肥胖大鼠的攝食行為進(jìn)行研究,現(xiàn)報道如下。

        1 材料與方法

        1.1 動物及飼養(yǎng)

        SPF級雄性SD大鼠50只,體重180~220 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度18~22℃,濕度40~70%,自由攝食、飲水,自然晝夜節(jié)律光照。常規(guī)飼料(熱量構(gòu)成為脂肪13%,蛋白質(zhì)23%,碳水化合物64%)及高脂飼料(熱量構(gòu)成為脂肪60%,蛋白質(zhì)20%,碳水化合物20%)均購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

        1.2 藥物及試劑

        活血降糖飲(黃芪30 g,生地20 g,丹參30 g,太子參30 g,五味子15 g,麥冬15 g,山藥12 g,黃精15 g,丹皮12 g,大黃16 g,紅花12 g,桃仁10 g)蒸餾水浸泡2 h后,大火煎開,小火繼續(xù)煎煮30 min,共2次,過濾濃縮為4 g/ml藥液,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩{}酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20023370)用蒸餾水溶解為濃度20 mg/ml藥液,4℃儲存。

        1.3 試劑及儀器

        總膽固醇(TC)、總?cè)8视?TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、血糖試劑盒購于南京建成生物工程研究所,游離脂肪酸(NEFA)試劑盒購自日本和光純藥工業(yè)株式會社,胰島素放免試劑盒購于北京原子能科學(xué)研究所。兔抗大鼠CD36多克隆抗體、β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司,蛋白抽提試劑盒及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德生物公司。檢測儀器包括北京六一儀器廠DYCZ-24型垂直板電泳槽等。

        1.4 實驗方法

        1.4.1 動物模型和分組 經(jīng)過1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后,隨機(jī)選出10只大鼠作為正常對照組,常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。其余大鼠以高脂高熱卡飲食喂養(yǎng)8周后,篩選出30只血脂及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)異常的作為成模大鼠(根據(jù)以上指標(biāo)計算95%可信區(qū)間,數(shù)據(jù)均高于正常范圍上線20%認(rèn)為模型成功),將其隨機(jī)分為模型組、中藥組、二甲雙胍組,每組10只。

        1.4.2 動物處理 正常組和模型組以適量體積生理鹽水灌胃,中藥組以5 g/(kg·d)劑量灌服活血降糖飲,二甲雙胍組以200 mg/(kg·d)劑量灌胃二甲雙胍。正常組喂以常規(guī)飼料,其他組均繼續(xù)喂以高脂高熱卡飼料。各組干預(yù)8周后,進(jìn)行雙瓶喜好實驗,檢測大鼠對膳食脂肪的偏好。1周后,禁食24 h,腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后,腹主動脈采血,分離血清,檢測血脂、游離脂肪酸、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS);斷頭,取腦組織,冰上分離海馬組織,經(jīng)過液氮后保存于-80℃冰箱。

        1.4.3 指標(biāo)測量 ①按照說明書檢測各血清學(xué)指標(biāo);②雙瓶喜好實驗:將標(biāo)號、稱重過的盛有純水和20%亞油酸(LA)的200 ml飲水瓶,分別插入鼠籠籠蓋左右兩端(LA水在左,純水在右)1 h,1 h后交換2瓶位置,再過1 h后將飲水瓶取下,稱重;脂肪偏好度=[2h 20%亞油酸飲用量/(2h 20%亞油酸飲用量+2h純水飲用量)]×100%;③western blot檢測海馬組織CD36蛋白表達(dá):海馬組織總蛋白提取按照蛋白抽提試劑盒說明書操作,考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白濃度;10% SDS-PAGE凝膠電泳(各樣品上樣量均為50μg),濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜后,封閉2 h,一抗4℃孵育過夜(抗體工作濃度為1∶1000),次日經(jīng)TBST洗膜后用二抗孵育2 h(二抗工作濃度為1∶5000),進(jìn)行雜交ECL化學(xué)發(fā)光,分析各條帶的吸光度值,用蛋白/內(nèi)參的比值表示各蛋白的表達(dá)量。

        1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

        2 結(jié)果

        2.1 活血降糖飲對大鼠體重的影響

        模型組大鼠體重明顯高于正常組,治療后,中藥組和二甲雙胍組大鼠體重明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

        表1 各組大鼠體重比較

        與正常組比較**P<0.01;與模型組比較△△P<0.01

        2.2 活血降糖飲對大鼠FPG、FINS以及HOMA-IR的影響

        模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均明顯高于正常組;治療后,中藥組和二甲雙胍組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR均較模型組有不同程度降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表2。

        表2 各組大鼠FPG、FINS及HOMA-IR比較

        與正常組比較**P<0.01;與模型組比較△P<0.05,△△P<0.01

        2.3 活血降糖飲對大鼠血脂水平的影響

        與正常組比較,模型組大鼠TC、TG、LDL-c、NEFA均明顯升高,HDL-c明顯下降(P<0.01);與模型組比較,中藥組和二甲雙胍組TC、TG、LDL-c、NEFA均有不同程度下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);而中藥組和二甲雙胍組HDL-c與模型組比較無明顯變化(P>0.05)。見表3。

        表3 各組大鼠血脂比較

        與正常組比較**P<0.01;與模型組比較△△P<0.01

        2.4 活血降糖飲對大鼠脂肪偏好度的影響

        與正常組比較,模型組大鼠脂肪偏好度明顯增加;與模型組比較,中藥組和二甲雙胍組脂肪偏好度明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表4。

        表4 各組大鼠脂肪偏好度

        與正常組比較**P<0.01;與模型組比較△△P<0.01

        2.5 活血降糖飲對大鼠海馬組織CD36表達(dá)的影響

        與正常組比較,模型組大鼠海馬組織中CD36蛋白表達(dá)明顯增加;與模型組比較,中藥組和二甲雙胍組海馬組織中CD36蛋白表達(dá)明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

        A:正常組;B:模型組;C:中藥組;D:二甲雙胍組與正常組比較**P<0.01;與模型組比較△△P<0.01圖1 各組大鼠海馬組織CD36蛋白表達(dá)

        3 討論

        攝食是人體維持生命的重要生理行為,過量攝取高脂高熱卡飲食會增加代謝性疾病的發(fā)生[6]。根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“未病先防,既病防變”的思想,可通過抑制對膳食脂肪的偏好控制高脂飲食的攝入量,從而預(yù)防代謝性疾病的發(fā)生和進(jìn)展。

        傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為“胃氣”與人的健康關(guān)系密切,而食欲由“胃氣”決定。因此,注意顧護(hù)“胃氣”,也就增加了食欲。對“胃氣”的抑制,多出現(xiàn)在一些中藥的不良反應(yīng)中,比如滋陰藥,大多“滋膩礙胃”。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)中藥對食欲抑制有間接作用,比如Wang J等[7]學(xué)者證實了苦寒藥和滋陰藥有“礙胃”之嫌,在應(yīng)用黃連生脈飲(黃連、黃芪、黨參、麥冬、五味子、丹參、苦參、當(dāng)歸、酸棗仁)治療早搏的過程中,患者出現(xiàn)食欲減退。中醫(yī)多以“三消”理論指導(dǎo)治療糖尿病,主要以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主,常應(yīng)用滋膩礙胃的滋陰藥和苦寒藥。

        本科室協(xié)定方活血降糖飲由黃芪、生地、丹參、太子參、黃精、五味子、麥冬、山藥、丹皮、紅花、桃仁、大黃等藥物組成,具有益氣養(yǎng)陰,清熱瀉濁,活血通絡(luò)的功效,臨床上用于治療Ⅱ型糖尿病,治療后患者多食易饑癥狀明顯改善。本研究結(jié)果表明,經(jīng)活血降糖飲治療后,肥胖大鼠脂肪偏好明顯降低,說明活血降糖飲對肥胖大鼠攝食行為中的飲食偏好具有調(diào)控作用。

        CD36是一種完整的細(xì)胞膜糖蛋白,其在細(xì)胞表面和溶酶體內(nèi)部均有表達(dá)。CD36屬于B族清道夫受體家族的多功能蛋白,其在脊椎動物的多種細(xì)胞均有表達(dá),如巨噬細(xì)胞、血小板、微血管內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞等[8]。CD36同時具有識別、轉(zhuǎn)運游離脂肪酸的多種功能。Laugerette F等[9]學(xué)者利用CD36基因敲除(CD36-/-)小鼠,通過雙瓶喜好實驗研究發(fā)現(xiàn),與野生型小鼠相比,在排除了嗅覺和觸覺等影響因素后,CD36-/-小鼠對2%亞油酸的偏好顯著減弱,且不能區(qū)別富含亞油酸的溶液和對照溶液,而CD36-/-小鼠對甜味的喜好和對苦味的厭惡感仍然存在,其結(jié)果說明CD36對于脂類的識別起著重要作用。臨床研究[10]結(jié)果則表明,在肥胖人群中,CD36表達(dá)增加的個體與CD36表達(dá)減少的個體相比,身高體重指數(shù)較高,膳食脂肪的攝入也較多。

        中樞神經(jīng)系統(tǒng)中關(guān)于CD36的研究較少,目前的研究發(fā)現(xiàn)CD36在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有多種功能,有研究[11]表明,CD36可能參與中性粒細(xì)胞吞噬作用的調(diào)控,有助于減輕缺血后的炎癥反應(yīng),促進(jìn)組織修復(fù),還有研究[12]發(fā)現(xiàn)CD36缺失可以延緩阿爾茨海默病認(rèn)知功能的惡化。同時,有研究[13]表明CD36參與脂質(zhì)感知,但是具體作用機(jī)制仍不明確。

        本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),活血降糖飲具有良好的減重、調(diào)脂和減輕胰島素抵抗的作用,這與本課題組以往研究結(jié)果類似。同時本研究還發(fā)現(xiàn)經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和胰島素抵抗大鼠對膳食脂肪偏好明顯增加,其海馬組織中CD36蛋白表達(dá)也明顯上調(diào)。經(jīng)中藥和二甲雙胍干預(yù)后,這種改變被糾正?;钛堤秋嬒抡{(diào)海馬組織CD36蛋白表達(dá)可能是其調(diào)控大鼠對膳食脂肪偏好的作用機(jī)制之一,但這兩者之間的關(guān)聯(lián),以及胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白表達(dá)的調(diào)控等具體作用機(jī)制,仍需進(jìn)一步研究。

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