余亮 譚自明 張斌 趙晶 木哈達(dá)斯·吐?tīng)栠d依明 李奇鳳 羅新輝 孫荷

摘 要：目的 了解甘露糖結(jié)合凝集素基因多態(tài)性與新疆喀什地區(qū)結(jié)核病易感性的關(guān)系。方法 選取2015年12月～2017年12月在新疆喀什地區(qū)收集肺結(jié)核患者193例血液樣本，收集同時(shí)期健康體檢人員142例血液樣本，采用試劑盒法提取全血基因組DNA，采用英國(guó)LGC公司生產(chǎn)的基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）技術(shù)的SNPline基因分型平臺(tái)對(duì)選定的MBL基因SNP位點(diǎn)rs7096206進(jìn)行分型，獲得該位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率。結(jié)果 MBL基因rs7096206位點(diǎn)的三個(gè)基因型CC、GC、GG在結(jié)核患者組和對(duì)照組中的分布，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但從等位基因在兩組間的分布上看，突變型堿基G在結(jié)核患者組中的頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 MBL基因rs7096206多態(tài)性位點(diǎn)與新疆結(jié)核病易感性存在關(guān)聯(lián)，攜帶G堿基比攜帶C堿基具有更高的結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：甘露糖結(jié)合凝集素（MBL）；結(jié)核病；基因多態(tài)性；新疆

中圖分類(lèi)號(hào)：R521 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.13.019

文章編號(hào)：1006-1959（2018）13-0065-03

Abstract：Objective To investigate the relationship between mannose-binding lectin gene polymorphism and susceptibility to tuberculosis in Kashgar，Xinjiang.Methods From December 2015 to December 2017，193 blood samples of pulmonary tuberculosis patients were collected in Kashgar，Xinjiang.142 blood samples were collected from concurrent health checkups.The whole blood genomic DNA was extracted by kit method，and the selected SNP locus rs7096206 was obtained by SNPline genotyping platform based on competitive allele-specific PCR（KASP）technology produced by LGC，UK.Genotypic frequency and allele frequency of this locus. Results There were no significant differences in the distribution of three genotypes CC，GC and GG of MBL gene rs7096206 in tuberculosis patients and control group（P>0.05），but the distribution of alleles between the two groups was observed.The frequency of mutant base G in the tuberculosis group was higher than that in the control group，and the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion The polymorphism of MBL gene rs7096206 is associated with susceptibility to tuberculosis in Xinjiang，and carrying G bases has a higher risk of tuberculosis than carrying C bases.

Key words：Mannose binding lectin（MBL）；Tuberculosis；Gene polymorphism；Xinjiang

結(jié)核?。╰uberculosis）是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的傳染病，據(jù)報(bào)道，全球超過(guò)1/3的人口曾經(jīng)感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，但感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌的人群中只有不到10%的人會(huì)發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核患者，個(gè)體的遺傳因素可能導(dǎo)致結(jié)核病易感性的差異，遺傳因素，宿主的基因可能在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中起到至關(guān)重要的作用[1]。易感基因在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注，甘露糖結(jié)合凝集素（MBL）是一種能特異識(shí)別糖類(lèi)并與之共價(jià)結(jié)合的糖蛋白，廣泛分布于人的肝臟和血液中，通過(guò)補(bǔ)體系統(tǒng)參與機(jī)體的微生物防御反應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[2]，人MBL基因位于10號(hào)染色體10q11.2區(qū)，含有5個(gè)外顯子，MBL基因突變可能影響MBL的二級(jí)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生無(wú)活性的寡聚體，導(dǎo)致血清中的MBL濃度降低，MBL基因多態(tài)性可能對(duì)結(jié)核病的易感性產(chǎn)生影響。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象 選取2015年12月～2017年12月在新疆喀什地區(qū)收集肺結(jié)核患者193例為病例組，所有病例確診均嚴(yán)格按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的《臨床診療指南：結(jié)核病分冊(cè)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，胸部X線檢查發(fā)現(xiàn)肺部組織存在典型的活動(dòng)性結(jié)核病變，肺部病變標(biāo)本、病理學(xué)診斷為結(jié)核病變；在患者知情同意的情況下，填寫(xiě)調(diào)查表，調(diào)查內(nèi)容包括患者的性別、年齡、民族、身高、體重、職業(yè)、婚姻狀況、學(xué)歷、飲酒、吸煙、飲茶、卡介苗接種史的情況等。收集同時(shí)期健康體檢人員142例為對(duì)照組，性別和年齡與結(jié)核患者組相匹配。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為：①X線檢查未發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核病灶、病理性鈣化灶和病理性肺陰影；②無(wú)結(jié)核病史；③無(wú)糖尿病、嚴(yán)重心、肝、腎等器質(zhì)性病變；④與病例組的患者無(wú)血緣關(guān)系。

1.2方法

1.2.1采用血液樣本 EDTA抗凝管采集研究對(duì)象晨起空腹靜脈血3 ml，搖晃后置于冰箱冷藏備用。

1.2.2提取血液DNA 使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的基因組DNA提取試劑盒（血液/細(xì)胞/組織）提取全血基因組DNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作：取一支EP管，管中加入300 μl抗凝血，再加入900 μl細(xì)胞裂解液A，溫和混勾，12000 rpm離心1 min，小心棄去上清，留下細(xì)胞核沉淀；向沉淀中加入600 μl緩沖液B，溫和震蕩混勾，加入10 μl蛋白酶K，顛倒10次混勻（約15 s），65 ℃水浴15～30 min至沉淀完全裂解；將混勻的液體轉(zhuǎn)入離心柱中，靜置2 min，12000 rpm，離心1 min，棄廢液；再次12000 rpm離心2 min，將離心柱置于新離心管中，并打開(kāi)離心柱蓋，于室溫放置5～10 min至無(wú)明顯乙醇味；在硅質(zhì)膜中央加入100 μl Solution E，置于室溫5 min后，12000 rpm離心2 min；離心得到的溶液再次加入離心柱中，室溫放置2 min，12000 rpm離心2 min，所得到的溶液?jiǎn)柤兓蟮腄NA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA濃度和純度的測(cè)定 采用美國(guó)Gene公司生產(chǎn)的微量核酸測(cè)定儀Nonodrop Lite檢測(cè)DNA濃度和純度，濃度低于10 ng/μl或A260/A280比值過(guò)大或過(guò)小的樣本將被棄用。

1.2.4基因分型 采用英國(guó)LGC公司生產(chǎn)的基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR（KASP）技術(shù)的SNPline基因分型平臺(tái)對(duì)選定的MBL基因SNP位點(diǎn)rs7096206進(jìn)行分型，獲得該位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率。引物序列為F：5'-ACGTTGGATGACGGTCCCATTTGTTCTCAC-3'，R：5'-ACGTTGGATGTTCATCTGTGCCTAGACACC-3'。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用EXECL 2003錄入數(shù)據(jù)，SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，組間各位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率差異比較采用？字2 檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用非條件Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析，計(jì)算比值比（OR）及95%置信區(qū)間（CI）。

2結(jié)果

2.1一般資料 共收集結(jié)核患者193例，其中男性99例，女性94例，年齡19～87歲，平均年齡（59.83±14.86）歲；共收集同時(shí)期健康體檢人員（對(duì)照組）142例，其中男性78例，女性64例，年齡19～79歲，平均年齡（52.63±18.81）歲；兩組間在性別和年齡上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 MBL基因rs7096206位點(diǎn)基因型在結(jié)核患者組和對(duì)照組中的分布 結(jié)核患者組中MBL基因rs7096206位點(diǎn)的野生型CC、雜合型GC、突變型GG三種基因型占比分別為61.66%（119/193）、36.79%（71/193）、1.55%（3/193），在142例對(duì)照組中三種基因型占比分別為72.53%（103/142）、26.76%（38/142）、0.70%（1/142），可見(jiàn)突變型堿基G在結(jié)核患者組的比例要高于對(duì)照組，但經(jīng)過(guò)？字2檢驗(yàn)，MBL基因rs7096206位點(diǎn)的三種基因型在結(jié)核患者組與對(duì)照組之間的分布差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2 =4.484，P=0.106>0.05）。

2.3 MBL基因rs7096206位點(diǎn)等位基因C和G在結(jié)核患者組和對(duì)照組中的分布 結(jié)核患者組等位基因C和G的頻率分別為80.05%（309/386）、19.95%（77/386），對(duì)照組等位基因C和G的頻率分別為85.91（244/284）、14.08%（40/284），經(jīng)過(guò)？字2 檢驗(yàn)，等位基因在兩組間的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2 =3.903，P=0.048<0.05），突變型堿基G在結(jié)核患者組中的分布顯著高于對(duì)照組，可見(jiàn)，攜帶G堿基比攜帶C堿基具有更高的結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

2.4 環(huán)境與遺傳對(duì)結(jié)核病發(fā)病的多因素分析 為排除其他危險(xiǎn)因素的影響，采用多因素非條件Logistic回歸模型，以結(jié)核患者組和對(duì)照組為因變量，以MBL基因rs7096206位點(diǎn)基因型為分類(lèi)自變量，在調(diào)整了性別、年齡、吸煙、飲酒等因素后，分析MBL基因rs7096206位點(diǎn)與結(jié)核病易感性的關(guān)系，結(jié)果顯示純合突變GG基因型和雜合突變CG基因型在結(jié)核病患者組中的分布顯著高于對(duì)照組，攜帶純合突變GG基因型的個(gè)體患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶野生CC基因型的2.56倍（P<0.05，OR=2.56，95%CI：1.67-3.91），攜帶雜合突變CG基因型的個(gè)體患結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶野生CC基因型的1.27倍（P<0.05，OR=1.27，95%CI：0.82～1.95）。

3討論

結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展是由遺傳因素和環(huán)境因素共同決定的，宿主易感基因在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中的作用越來(lái)越受到重視，眾多與結(jié)核病易感性有關(guān)的基因浮現(xiàn)于學(xué)者們的視野中，MBL是鈣離子依賴(lài)型凝集素成員之一，是機(jī)體免疫的一個(gè)重要組成部分，它能夠特異性識(shí)別和結(jié)合多種病原體表面糖蛋白鏈末端的甘露糖殘基，從而激活補(bǔ)體系統(tǒng)的免疫防御和免疫監(jiān)視的作用[4]。

目前，關(guān)于MBL基因多態(tài)性與結(jié)核病易感性的關(guān)系，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有了多項(xiàng)研究，但尚未形成共識(shí)。美國(guó)一項(xiàng)研究認(rèn)為MBL基因在美國(guó)的部分非洲裔人群和印度人群中等位基因的突變率明顯高于對(duì)照組，MBL基因突變?cè)黾咏Y(jié)核病的感染風(fēng)險(xiǎn)，但在白種人和西班牙裔人群中的研究數(shù)據(jù)卻沒(méi)有顯示出MBL基因多態(tài)性與結(jié)核病有關(guān)[5]；國(guó)內(nèi)劉洋等人采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)對(duì)112例結(jié)核患者和120例健康對(duì)照者的MBL基因進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者雜合子突變率高于對(duì)照組，因此認(rèn)為MBL基因多態(tài)性可能與肺結(jié)核易感性有關(guān)，并與肺結(jié)核的復(fù)發(fā)相關(guān)[6]；Chen M等人通過(guò)對(duì)205例肺結(jié)核患者和216例對(duì)照者的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，MBL基因rs7096206位點(diǎn)多態(tài)性與結(jié)核病易感性有關(guān)[7]。

本研究結(jié)果顯示，MBL基因rs7096206位點(diǎn)的三種基因型在新疆喀什地區(qū)結(jié)核患者組和對(duì)照組間的分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是等位基因在兩組間的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，突變型等位基因G在結(jié)核患者組中的分布高于對(duì)照組，MBL基因rs7096206位點(diǎn)堿基G可能是結(jié)核病的危險(xiǎn)因素，本研究結(jié)論與新疆塔城地區(qū)的開(kāi)展的一項(xiàng)研究結(jié)論相似，李宇等人在新疆塔城地區(qū)收集了231例肺結(jié)核患者和226例就健康對(duì)照，對(duì)MBL基因進(jìn)行了多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)肺結(jié)核組GG基因型顯著高于健康對(duì)照組，認(rèn)為MBL基因與新疆人群結(jié)核病相關(guān)，其可能是當(dāng)?shù)厝巳航Y(jié)核病的易感基因[8]。

研究基因多態(tài)性和疾病易感性關(guān)系時(shí)，由于受遺傳或環(huán)境等其它混雜危險(xiǎn)因素的影響，加之樣本量又不足夠大，容易導(dǎo)致研究結(jié)果無(wú)法真實(shí)反映基因與疾病之間的關(guān)系，為此本研究將性別、年齡、吸煙、飲酒、飲茶、卡介苗接種史等因素作為協(xié)變量納入多因素Logistic回歸模型中進(jìn)行分析，結(jié)果顯示攜帶GG或GC基因型的個(gè)體比攜帶CC基因型具有更高的結(jié)核病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這與一項(xiàng)博士畢業(yè)論文的研究結(jié)果較為相似，陳夢(mèng)施等人在湖南省隨機(jī)抽取了4個(gè)縣級(jí)疾病預(yù)防控制中心登記的肺結(jié)核患者503例，將性別、年齡、婚姻、受教育程度、BMI等因素作為協(xié)變量進(jìn)行多因素非條件Logistis回歸分析，認(rèn)為MBL基因rs7096206位點(diǎn)的GC基因型在肺結(jié)核患者租的分布高于健康對(duì)照組（P<0.05），GC基因型個(gè)體患結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的1.427倍（OR=1.427）[9]。

關(guān)于MBL基因與結(jié)核病易感性的關(guān)聯(lián)已經(jīng)有了很多研究，但針對(duì)不同種族不同人群的研究并沒(méi)有得到相對(duì)統(tǒng)一的結(jié)論，且MBL基因在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制也尚不明確，有待于進(jìn)一步研究和探索。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wu L，Deng H，Zheng Y，et al.An association study of NRAMP1，VDR，MBL and their interaction with the susceptibility to tuberculosis in a Chinese population[J].Internation J ournal Infectious Diseases，2015，38（C）：129-135.

[2]Hijikata M，Matsushita I，Hang NT，et al.Age dependent association of mannose binding lectin polymorphisms with the development of pulmonary tuberculosis in Viet Mam[J].Hum Immunol，2014，75（8）：840-846.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì).臨床診療指南：結(jié)核病分冊(cè)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[4]Garred P，Genster N，Pilely K，et al.A journey through the lectin pathway of complement-MBL and beyond[J].Immunol Rev，2016，274（1）：74-97.

[5]楊春娥，馮喜英，久太.結(jié)核病易感基因的研究現(xiàn)狀[J].中華肺部疾病雜志，2016，9（2）：207-209.

[6]劉洋，郭艷玲，孫琦，等.甘露醇結(jié)合凝集素基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性關(guān)系的研究[J].中國(guó)肺科雜志，2015，20（6）：971-974.

[7]Chen M，Deng J，Su C，et al.Impact of passive smoking，cooking with solid fuel exposure，and MBL MASP-2 gene polymorphism up-on susceptibility to tuberculosis[J].Int J Infect Dis，2014（29）：1-6.

[8]李宇，吳芳，章樂(lè)，等.MBL基因多態(tài)性與新疆漢族人群結(jié)核病易感性的研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2011，27（9）：769-773.

[9]陳夢(mèng)施.湖南省漢族人群MBL與MASP2基因多態(tài)性與相關(guān)因素對(duì)結(jié)核易感性的綜合影響研究[D].中南大學(xué)，2014：1-112.

收稿日期：2018-5-25；修回日期：2018-5-30

編輯/李樺