張寧媛，黃國(guó)寧，范立青，馮云，沈浣，劉平，盧文紅，張?jiān)粕?，王秀霞，張松英，黃學(xué)鋒，伍瓊芳，全松，周燦權(quán)，周從容，師娟子，孫瑩璞，孫海翔

(中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)第四屆委員會(huì))

背 景

遺傳性疾病是出生缺陷的主要形式，絕大部分遺傳性疾病缺乏有效治療方法，是人類生殖健康面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(preimplantation genetic diagnosis/screening，PGD/PGS)是在胚胎植入子宮前對(duì)胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)，選擇正?；蛘卟恢虏∨咛ヒ浦病GD主要針對(duì)事先已經(jīng)明確病因的遺傳性疾病患者，在種植前對(duì)胚胎進(jìn)行相應(yīng)遺傳學(xué)診斷，主要包括單基因病(如地中海貧血、遺傳性耳聾等)和染色體病(如羅氏易位、相互易位等)。而PGS主要針對(duì)高齡、反復(fù)助孕失敗、反復(fù)自然流產(chǎn)等患者，進(jìn)行植入前胚胎的染色體非整倍性檢測(cè)。

PGD/PGS技術(shù)從源頭上避免了遺傳性缺陷胚胎的種植，較之傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查具有明確的時(shí)間優(yōu)勢(shì)，避免可能的治療性引產(chǎn)給母體帶來(lái)的生理、心理傷害以及倫理問(wèn)題。PGD/PGS技術(shù)的設(shè)想最早由Edwards提出，1968年開(kāi)始動(dòng)物試驗(yàn)[1]，此后不斷拓展。PGD/PGS技術(shù)的臨床應(yīng)用已有近30年的歷史。伴隨胚胎培養(yǎng)與活檢技術(shù)、新型高通量診斷方法的發(fā)展，PGD/PGS的臨床應(yīng)用范圍更加廣泛。如何減少體外操作對(duì)胚胎發(fā)育潛能的影響，同時(shí)提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性，仍是PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室技術(shù)中亟待規(guī)范的問(wèn)題。

方 法

在中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)的倡議和領(lǐng)導(dǎo)下，分析1973～2016年Medline引文出版的臨床試驗(yàn)主要證據(jù)與薈萃分析結(jié)果，以“preimplantation genetic diagnosis”或“preimplantation genetic screening”為MeSH Terms，檢出文獻(xiàn)2 746篇。參照歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)(European Society for Human Reproduction and Embryology，ESHRE)PGD分會(huì)2005年發(fā)布的PGD/PGS臨床指南[2]、2011年發(fā)布的PGD中心組織管理[3]、基于擴(kuò)增方法的檢測(cè)技術(shù)[4]、基于FISH方法的檢測(cè)技術(shù)[5]和活檢技術(shù)[6]等4個(gè)方面的指南，以及美國(guó)PGD國(guó)際協(xié)會(huì)(Preimplantation Genetic Diagnosis International Society，PGDIS)2008 年修訂的PGD操作流程及實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保障指南[7]、中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)2017年試行的“高通量基因測(cè)序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷和篩查技術(shù)規(guī)范(試行)”[8]，由中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)實(shí)驗(yàn)室學(xué)組的專家共同討論，制定此PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室技術(shù)指南，以期規(guī)范PGD/PGS相關(guān)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的實(shí)踐與管理。

一、指南發(fā)起和支持單位

本指南由中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)發(fā)起和負(fù)責(zé)制訂。

二、指南注冊(cè)與計(jì)劃書撰寫

本指南已在國(guó)際實(shí)踐指南注冊(cè)平臺(tái)(International Practice Guidelines Registry Platform，IPGRP)進(jìn)行了注冊(cè)(注冊(cè)號(hào)為IPGRP-2017CN040)，讀者可聯(lián)系該注冊(cè)平臺(tái)索要指南的計(jì)劃書。

三、指南使用者與目標(biāo)人群

該指南適用于開(kāi)展胚胎植入前遺傳學(xué)診斷與篩查技術(shù)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)。指南的使用人群為從事生殖醫(yī)學(xué)和婦產(chǎn)科學(xué)的醫(yī)務(wù)工作者。

四、證據(jù)評(píng)價(jià)與分級(jí)

依據(jù)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的五級(jí)證據(jù)等級(jí)進(jìn)行分級(jí)。Ⅰ級(jí)證據(jù)來(lái)源：按照特定病種的特定療法收集所有質(zhì)量可靠的RCT以及對(duì)其所做的系統(tǒng)性評(píng)價(jià)或Meta分析；Ⅱ級(jí)證據(jù)來(lái)源：?jiǎn)蝹€(gè)的樣本量足夠的RCT研究；Ⅲ級(jí)證據(jù)來(lái)源：設(shè)有對(duì)照組但未用隨機(jī)方法分組的研究；Ⅳ級(jí)證據(jù)來(lái)源：無(wú)對(duì)照的系列病例觀察；Ⅴ級(jí)證據(jù)來(lái)源：專家意見(jiàn)、個(gè)案報(bào)道和臨床總結(jié)。

主要推薦意見(jiàn)證據(jù)級(jí)別分為：A級(jí)：強(qiáng)力推薦(證據(jù)肯定，能改善健康結(jié)局，利大于弊)；B級(jí)：推薦(有較好證據(jù)，能改善健康結(jié)局，利大于弊)；C級(jí)：不作為常規(guī)推薦(有證據(jù)能改善健康結(jié)局，但無(wú)法明確風(fēng)險(xiǎn)獲益比)；D級(jí)：不推薦(證據(jù)不足或?qū)】到Y(jié)局弊大于利)。

五、指南的傳播與實(shí)施

指南發(fā)布后，將主要通過(guò)以下方式對(duì)指南進(jìn)行傳播和推廣：①在相關(guān)學(xué)術(shù)會(huì)議中進(jìn)行解讀；②有計(jì)劃地在中國(guó)部分省份組織指南推廣專場(chǎng)，確保醫(yī)務(wù)工作者充分了解并正確應(yīng)用本指南；③在學(xué)術(shù)期刊中發(fā)表本指南；④通過(guò)微信或其他媒體進(jìn)行推廣。

結(jié) 果

表1 主要推薦意見(jiàn)

一、PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室管理

指南意見(jiàn)：PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程和人員專項(xiàng)培訓(xùn)制度。

PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立在經(jīng)省級(jí)醫(yī)療行政管理部門批準(zhǔn)開(kāi)展植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)的試點(diǎn)或正式運(yùn)行的醫(yī)療機(jī)構(gòu)。PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具備的場(chǎng)地、設(shè)備、人員要求參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)的“高通量基因測(cè)序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷和篩查技術(shù)規(guī)范(試行)”[8]。

PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程。PGD/PGS操作手冊(cè)應(yīng)包括授精與胚胎培養(yǎng)、胚胎活檢、遺傳學(xué)檢測(cè)、胚胎凍融、胚胎移植等相關(guān)技術(shù)流程和操作細(xì)節(jié)要求，并及時(shí)更新，定期進(jìn)行自查。

PGD/PGS針對(duì)的是單細(xì)胞或幾個(gè)細(xì)胞的微量DNA，遺傳診斷的難度大，對(duì)診斷結(jié)果的可靠性要求也更高。因技術(shù)的特殊要求，PGDIS推薦對(duì)PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員進(jìn)行嚴(yán)格的專項(xiàng)培訓(xùn)。為避免外源性細(xì)胞或DNA污染，在實(shí)施PCR操作時(shí)尤其需要嚴(yán)格遵循操作規(guī)范。在缺少單細(xì)胞診斷正規(guī)培訓(xùn)的情況下，生殖中心可通過(guò)強(qiáng)化安全教育和操作流程的監(jiān)督，使其嚴(yán)格落實(shí)標(biāo)本標(biāo)記及確認(rèn)的雙人核對(duì)制度；通過(guò)加強(qiáng)對(duì)儀器與操作技術(shù)的訓(xùn)練，使其熟練掌握授精與胚胎培養(yǎng)、胚胎活檢等核心操作技術(shù)；通過(guò)數(shù)據(jù)收集與分析水平的訓(xùn)練，使其提高PGD結(jié)果的判別技能以甄選可供移植的胚胎。PGD/PGS檢測(cè)應(yīng)嚴(yán)格遵守國(guó)家法律及衛(wèi)生行政部門頒發(fā)的法規(guī)，嚴(yán)格禁止無(wú)醫(yī)學(xué)指征的性別篩查，PGD/PGS報(bào)告中必須隱藏與胚胎性別相關(guān)的信息。

二、PGD/PGS采用的授精與胚胎培養(yǎng)方式

指南意見(jiàn)：授精采用ICSI方式，以避免親源遺傳物質(zhì)的污染。卵子與胚胎培養(yǎng)采用單滴培養(yǎng)方式，以確保胚胎和活檢材料、活檢結(jié)果一一對(duì)應(yīng)。

PGD/PGS患者的授精方式與胚胎培養(yǎng)模式的選擇，需充分考慮到PGD/PGS操作的需要，同時(shí)避免父源和母源性遺傳物質(zhì)污染的可能。

1.授精方式：ESHRE PGD協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)連續(xù)10年的PGD/PGS數(shù)據(jù)，其中采用ICSI授精方式的有23 830個(gè)周期、采用IVF方式3 113個(gè)周期[9](Ⅲ級(jí))。絕大部分PGD/PGS周期采用ICSI授精方式，保障受精率同時(shí)，避免精子滯留透明帶中造成父源遺傳物質(zhì)的污染[2，9](Ⅲ級(jí))。ICSI前去除顆粒細(xì)胞操作應(yīng)將卵周顆粒細(xì)胞清除干凈以避免母源遺傳物質(zhì)的污染[10]。

2.胚胎培養(yǎng)方式：胚胎活檢之前的培養(yǎng)模式同常規(guī)IVF周期[11]，建議單滴培養(yǎng)?；顧z過(guò)程中需要嚴(yán)格標(biāo)識(shí)?；顧z后卵子或胚胎行單滴培養(yǎng)，也可以單枚卵子或胚胎放置單獨(dú)培養(yǎng)皿，確?；顧z標(biāo)本與活檢后卵子或胚胎一一對(duì)應(yīng)[6]?；顧z后卵子或胚胎應(yīng)充分洗滌祛除活檢使用的操作液[6]。

三、PGD/PGS采用的卵子與胚胎活檢方法

指南意見(jiàn)：胚胎活檢時(shí)機(jī)選擇滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢透明帶打孔采用激光法。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢方法采用激光或機(jī)械切割法。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢數(shù)量要求：滋養(yǎng)層細(xì)胞達(dá)到A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可活檢6個(gè)以上細(xì)胞，達(dá)不到A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)活檢3～6個(gè)細(xì)胞。

(一)活檢時(shí)機(jī)

PGD/PGS是針對(duì)植入前胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)診斷，卵子(極體活檢間接反映胚胎遺傳信息)、分裂期胚胎或囊胚三個(gè)階段都可以進(jìn)行活檢，獲取遺傳物質(zhì)，進(jìn)行遺傳學(xué)診斷。因此，根據(jù)活檢時(shí)機(jī)的不同可分為極體活檢、卵裂球活檢和囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。

1.極體活檢：極體活檢包括MⅡ期卵細(xì)胞和/或合子中進(jìn)行極體的活檢，分為第一極體活檢和第二極體活檢。第一極體活檢于取卵當(dāng)天即HCG注射后36～42 h進(jìn)行[12]，第二極體活檢在受精觀察當(dāng)日[13]。可在受精后9～22 h內(nèi)同時(shí)活檢第一極體和第二極體，但是受精22 h第一極體有可能發(fā)生降解[14](Ⅲ級(jí))。極體活檢用于PGD/PGS基于：極體是卵子減數(shù)分裂過(guò)程中的產(chǎn)物，根據(jù)其檢測(cè)結(jié)果可以間接推測(cè)卵子的遺傳信息，從而預(yù)測(cè)來(lái)自母親的遺傳缺陷對(duì)胚胎的影響。極體活檢相比植入前其他階段具有較少的侵入性，來(lái)自第一次減數(shù)分裂的第一極體或來(lái)自第二次減數(shù)分裂的第二極體，對(duì)于植入前及植入后胚胎的發(fā)育影響較小。Strom等[15]對(duì)經(jīng)連續(xù)極體活檢的PGD周期誕生的109個(gè)胎兒進(jìn)行生產(chǎn)和新生兒結(jié)局的調(diào)查，結(jié)果顯示經(jīng)雙極體活檢后出生胎兒的身長(zhǎng)和體重,以及出生缺陷方面都沒(méi)有顯著差異(Ⅲ級(jí))。

由于極體活檢只能間接反映母方遺傳信息，臨床應(yīng)用較為局限。由于有絲分裂和父系來(lái)源的非整倍體性不能被檢測(cè)到，Capalbo等[16]報(bào)道極體活檢具有較高的假陽(yáng)性和假陰性率(Ⅲ級(jí))。同時(shí)極體活檢尚不能預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育狀況，活檢樣本量多，也存在無(wú)效活檢。極體活檢結(jié)果也需要胚胎活檢結(jié)果的驗(yàn)證[6]。近幾十年來(lái)，歐洲極體活檢的比例已由原先的10%～15%進(jìn)一步下降。

2.卵裂球活檢：卵裂球活檢是在胚胎發(fā)育6～8細(xì)胞左右時(shí)，吸取1～2個(gè)卵裂球進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。此階段的卵裂球被認(rèn)為具有全能性。與極體活檢相比，卵裂球活檢的優(yōu)勢(shì)在于可以同時(shí)診斷父方和母方染色體異?；騿位蚣膊?。卵裂球活檢直接檢測(cè)胚胎的遺傳信息，并且可以剔除未受精和質(zhì)量差的胚胎，減少活檢樣本數(shù)量[17]。但分裂期胚胎活檢減少胚胎細(xì)胞數(shù)量，可能損傷胚胎，降低胚胎發(fā)育潛能[18](Ⅱ級(jí))。分裂期胚胎有40%～60%為嵌合體，對(duì)于嵌合體胚胎，卵裂階段單個(gè)卵裂球的檢測(cè)并不能完全代表整個(gè)胚胎的遺傳信息，導(dǎo)致漏診和異常胚胎的移植[6]。

3.滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢：滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢是在受精后5～6 d，胚胎發(fā)育至囊胚階段時(shí)，取一定數(shù)量的滋養(yǎng)層細(xì)胞用于遺傳檢測(cè)。囊胚階段胚胎細(xì)胞數(shù)量顯著增加，獲得的滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)可達(dá)10個(gè)，能夠提供更多的細(xì)胞用于檢測(cè)，從而提高PGD/PGS診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性。此階段胚胎嵌合減少，也提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確性，并且滋養(yǎng)層細(xì)胞將來(lái)發(fā)育成胎盤，降低了活檢對(duì)胚胎發(fā)育的影響[6]。但滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢需要胚胎發(fā)育到囊胚階段，要求具備一定的胚胎培養(yǎng)條件，胚胎有持續(xù)發(fā)育能力。約有40%的正常受精卵可在體外發(fā)育至囊胚階段，也限制了可供PGD/PGS診斷的胚胎數(shù)目。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢結(jié)果也可能存在與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的不一致性。

卵裂球活檢和滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢是常用的胚胎活檢時(shí)機(jī)。隨機(jī)配對(duì)試驗(yàn)結(jié)果顯示，囊胚活檢沒(méi)有降低胚胎種植潛能(囊胚活檢與未活檢者的種植率為51% vs.54%)，而分裂期胚胎活檢顯著降低了胚胎種植潛能(分裂期胚胎活檢與未活檢者的種植率為30% vs.50%)[19](Ⅱ級(jí))。比較囊胚活檢(Day5活檢，Day6移植)和分裂期胚胎活檢后培養(yǎng)至囊胚移植(Day3活檢，Day5移植)的臨床結(jié)局顯示，囊胚活檢的診斷率和胚胎種植率均高于分裂胚活檢(94.3%、47.6% vs.75.2%、26.7%)[20](Ⅱ級(jí))。鑒于囊胚期活檢的優(yōu)勢(shì)，越來(lái)越多的PGD/PGS周期采用滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢方式。

(二)活檢方法

PGD過(guò)程中的胚胎活檢是一種創(chuàng)傷性顯微操作，有可能影響活檢后胚胎發(fā)育能力。在進(jìn)行胚胎活檢之前需要在透明帶上打孔或者部分透明帶切除。

1.透明帶打孔方法：透明帶打孔主要有3種方法：化學(xué)法、機(jī)械法和激光法?；瘜W(xué)法主要是利用酸性液體消化透明帶形成孔洞，由于酸性液體可能會(huì)影響胚胎發(fā)育，目前很少應(yīng)用；機(jī)械法利用活檢針機(jī)械摩擦透明帶，形成孔洞，雖不存在化學(xué)物質(zhì)對(duì)胚胎的不利影響，但顯微操作技術(shù)難度相對(duì)高，操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)影響胚胎的細(xì)胞骨架，應(yīng)用也不廣泛；激光法利用激光消除透明帶，操作簡(jiǎn)單，可任意調(diào)節(jié)孔洞大小，不直接接觸胚胎，對(duì)胚胎發(fā)育影響小，是透明帶打孔最為常用的方法。Magli等[21]報(bào)道極體活檢時(shí)，機(jī)械或者激光法打孔對(duì)活檢成功率的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (Ⅲ級(jí))。ESHRE PGD協(xié)會(huì)2010年P(guān)GD/PGS病例統(tǒng)計(jì)顯示，激光法、化學(xué)法和機(jī)械法的應(yīng)用例數(shù)分別為4 250例、958例、443例[22]。

透明帶打孔的時(shí)機(jī)選擇，極體、分裂期胚胎活檢一般在活檢當(dāng)時(shí)進(jìn)行；囊胚期活檢可在第3天或第5天進(jìn)行透明帶打孔[20，23](Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí))。第3天打孔時(shí)可以選擇卵裂球與透明帶的間隙處，避免對(duì)胚胎細(xì)胞的傷害；第5天時(shí)囊胚已經(jīng)擴(kuò)張，能夠確定胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)所在位置，可以選擇在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對(duì)側(cè)進(jìn)行開(kāi)口，方便活檢。

2.胚胎活檢方法：對(duì)于分裂期胚胎，活檢在無(wú)鈣/鎂離子的溶液中進(jìn)行，以降低活檢細(xì)胞裂解的比率[24]?；顧z方法主要有抽吸法、機(jī)械切割法和激光切割法。抽吸法直接吸取極體[12]和分裂期卵裂球[25]，對(duì)囊胚而言可以在疝形成后使用激光法[21]或機(jī)械切割法獲取滋養(yǎng)層細(xì)胞[26]。目前常用的做法是在第3天或第5天時(shí)將透明帶開(kāi)口，待滋養(yǎng)層細(xì)胞從開(kāi)口處孵出，形成疝，對(duì)孵出細(xì)胞進(jìn)行取樣檢測(cè)[23，27]。

3.活檢對(duì)配子與胚胎質(zhì)量的影響：分裂期胚胎可以活檢1～2個(gè)細(xì)胞。相對(duì)于活檢對(duì)胚胎造成的損傷而言，分裂期胚胎本身的質(zhì)量與囊胚發(fā)育率之間的相關(guān)性更高[18](Ⅱ級(jí))?；顧z2個(gè)細(xì)胞較1個(gè)細(xì)胞降低囊胚發(fā)育率[18，28](Ⅱ級(jí))。但活檢1個(gè)細(xì)胞降低了PCR的診斷效率(88.6% vs.96.4%)，而對(duì)FISH方法的診斷效率沒(méi)有影響[18](Ⅱ級(jí))。兩者的活產(chǎn)率相當(dāng)[18](Ⅱ級(jí))。

胚胎發(fā)育至囊胚時(shí)大約有100～150個(gè)細(xì)胞，可以提供更多的細(xì)胞用于檢測(cè)。滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢時(shí)，診斷率隨活檢細(xì)胞數(shù)的增加而提高，1～5個(gè)細(xì)胞的診斷率從86.7%上升到98.7%，當(dāng)活檢細(xì)胞大于6個(gè)細(xì)胞時(shí)診斷率達(dá)到最大[29](Ⅲ級(jí))。而滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢數(shù)量對(duì)臨床結(jié)局的影響則和滋養(yǎng)層本身的發(fā)育狀況緊密相關(guān)，當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞達(dá)到A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，活檢細(xì)胞數(shù)量的多少對(duì)胚胎存活和種植率沒(méi)有顯著影響，而當(dāng)滋養(yǎng)層細(xì)胞在B、C級(jí)時(shí)，活檢細(xì)胞數(shù)量雖然對(duì)胚胎存活沒(méi)有顯著影響，但胚胎種植率隨活檢細(xì)胞數(shù)量的增加而下降[29](Ⅲ級(jí))。

研究胚胎活檢對(duì)新生兒結(jié)局的影響，顯示胚胎活檢后雖然出生胎齡降低，但活檢本身不會(huì)對(duì)宮腔內(nèi)生長(zhǎng)限制或者低體重造成影響[30](Ⅱ級(jí))。

四、PGD/PGS活檢胚胎的凍融

指南意見(jiàn)：活檢胚胎采用玻璃化冷凍方法保存。

囊胚活檢提供給遺傳學(xué)分析的時(shí)間較短，通常需要凍存胚胎[6]。PGD/PGS活檢后胚胎的冷凍與復(fù)蘇方法，參照未活檢胚胎的凍融方法[6]?；顧z后胚胎玻璃化冷凍存活率高于慢速冷凍[31](Ⅱ級(jí))。分裂期胚胎活檢后的冷凍存活率要低于完整胚胎(64.0% vs.92.0%)，而囊胚期胚胎活檢后的冷凍存活率不低于完整胚胎(95.7% vs.81.4%)[32](Ⅲ級(jí))。D3胚胎活檢后培養(yǎng)至囊胚冷凍，D5囊胚的存活率高于D6囊胚[33](Ⅲ級(jí))。因此，行囊胚期玻璃化冷凍是活檢胚胎冷凍保存的可行且有效方法。

活檢胚胎在冷凍過(guò)程中要一一對(duì)應(yīng)，避免混淆。胚胎編號(hào)要與檢測(cè)樣本以及診斷報(bào)告中保持一致，避免人為的誤診。

五、PGD/PGS的遺傳學(xué)檢測(cè)方法

指南意見(jiàn)：染色體疾病的遺傳學(xué)檢測(cè)可采用芯片類(如SNP芯片)或者NGS檢測(cè)方法。單基因病檢測(cè)可采用基因的PCR擴(kuò)增和/或測(cè)序技術(shù)。對(duì)突變位點(diǎn)檢測(cè)同時(shí)在其附近尋找分子標(biāo)記做連鎖分析，以降低PCR方法的誤診率。芯片類方法用于PGS的檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。

(一)常用遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)

胚胎的遺傳學(xué)診斷是PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室技術(shù)的重要步驟之一。傳統(tǒng)的單細(xì)胞診斷方法主要有熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。近年來(lái)新的遺傳學(xué)診斷技術(shù)，如比較基因組雜交技術(shù)(comparative genomic hybridization，CGH)、單核苷酸多態(tài)芯片檢測(cè)技術(shù)(SNP array)、以及新一代測(cè)序技術(shù)(NGS)等不斷地應(yīng)用于胚胎的遺傳學(xué)檢測(cè)。

1.PCR：PGD最先使用的方法，通過(guò)對(duì)基因組特定區(qū)域的特異性擴(kuò)增，結(jié)合凝膠電泳、酶切、測(cè)序等技術(shù)，可以檢測(cè)胚胎性別、特定基因的點(diǎn)突變、小片段缺失或插入等，也可以通過(guò)qPCR檢測(cè)染色體整倍性[34]。目前PCR技術(shù)主要應(yīng)用于單基因病的診斷。2014年ESHRE PGD聯(lián)盟通過(guò)6個(gè)PGD中心的以PCR技術(shù)為主的單基因病PGD數(shù)據(jù)，計(jì)算出診斷方法的準(zhǔn)確度為93.7%、敏感度為99.2%、特異度為80.9%[35](Ⅳ級(jí))。PCR技術(shù)面臨污染和等位基因脫扣的挑戰(zhàn)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果而導(dǎo)致誤診，因此建議和突變點(diǎn)附近的分子標(biāo)記檢測(cè)聯(lián)合使用，以降低PCR方法的誤診率[4]。

2.FISH：利用熒光標(biāo)記的特異性探針與處于間期的胚胎卵裂球DNA雜交，在熒光顯微鏡下觀察熒光信號(hào)的數(shù)量與分布，反映相應(yīng)染色體的數(shù)目與結(jié)構(gòu)[36]，常用于檢測(cè)13、14、15、18、21、22、X及Y染色體的數(shù)目異常。1994年該技術(shù)被首次應(yīng)用于胚胎性別診斷[6]。用DNA插入文庫(kù)來(lái)篩選結(jié)合鄰近或跨越染色體斷裂位點(diǎn)的DNA探針，為染色體倒位或者平衡易位的攜帶者提供一種檢測(cè)手段[37]，卵裂球活檢后檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常[38]。傳統(tǒng)的FISH使用的探針數(shù)目有限，僅能檢測(cè)部分染色體，不能完全排除胚胎非整倍體的可能性，最近也有將FISH應(yīng)用于24條染色體整倍性檢測(cè)的研究報(bào)道[39]。此外受卵裂球固定效果和探針的非特異性結(jié)合等影響，檢測(cè)結(jié)果難于判斷[40]，有時(shí)需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)做出主觀判斷，影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性，目前該方法有被其它技術(shù)取代的趨勢(shì)。

3.CGH：利用不同顏色的熒光標(biāo)記待測(cè)樣本和正?；蚪M的DNA，然后與正常人類中期染色體(CGH)或芯片(array CGH，aCGH)進(jìn)行雜交[41]，通過(guò)對(duì)比分析兩種熒光強(qiáng)度，反映待測(cè)樣本DNA信息[42-43]。傳統(tǒng)的CGH需要制備中期染色體，因而目前aCGH應(yīng)用更為廣泛。aCGH可以在基因組水平檢測(cè)染色體數(shù)目變化以及重復(fù)、缺失的情況[44]，但是這種方法不能區(qū)分其分辨率以下的片段缺失和重復(fù)，不能檢測(cè)整倍性的改變[45-46]，如三倍體胚胎、單親二倍體沒(méi)有辦法判斷。

4.SNP array：針對(duì)人類基因組平均每500～1 000 bp即含有的1個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)基因組范圍SNP位點(diǎn)的檢測(cè)同時(shí)可以反映染色體數(shù)目異常及片段異常[47]。SNP芯片檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)在于分辨率高，能夠得到每個(gè)胚胎的DNA指紋信息，在分析染色體數(shù)目和片段異常的同時(shí)，可以診斷單親二倍體、還可以確定妊娠胎兒是從哪一個(gè)胚胎發(fā)育而來(lái)[41]。

5.NGS：為新一代測(cè)序，相對(duì)于傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序，改變了測(cè)序的規(guī)?；M(jìn)程，能對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，但讀長(zhǎng)一般較短。將胚胎樣本DNA打斷，構(gòu)建文庫(kù)，通過(guò)測(cè)序后獲得的序列信息與人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)，可以分析染色體數(shù)量變化與片段異常[48]。2008年后全基因組測(cè)序費(fèi)用呈指數(shù)下降，為NGS的臨床應(yīng)用提供了條件。

(二)遺傳診斷技術(shù)的比較

1.性別鑒定：可以采用PCR技術(shù)對(duì)Y染色體重復(fù)序列進(jìn)行鑒定，也可選用FISH技術(shù)。早期研究對(duì)比了PCR和FISH在性別鑒定中的可靠性和精確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR優(yōu)于FISH[49](Ⅲ級(jí))，但FISH在倍性檢測(cè)中具有優(yōu)勢(shì)[50](Ⅲ級(jí))。

2.染色體結(jié)構(gòu)異常檢測(cè)：采用常用商業(yè)探針的FISH技術(shù)，可以區(qū)分平衡和非平衡的胚胎。如需區(qū)分正常或易位的染色體，則需要采用特殊制備的跨斷點(diǎn)探針。aCGH無(wú)法檢測(cè)出多倍體。相比于傳統(tǒng)的染色體核型分析技術(shù)，aCGH、SNP array和NGS均無(wú)法檢測(cè)出DNA拷貝數(shù)無(wú)變化的染色體結(jié)構(gòu)變異如平衡易位、倒位等[51](Ⅰ級(jí))。

3.單基因病檢測(cè)：可采用基因的PCR擴(kuò)增和/或測(cè)序技術(shù)。單基因病診斷用于特定的遺傳病時(shí)，采用特異引物通過(guò)PCR技術(shù)診斷。

4.非整倍體篩查：array CGH、SNP array、NGS技術(shù)可以檢測(cè)所有染色體的非整倍體和片段異常，已取代多輪雜交FISH技術(shù)。隨機(jī)對(duì)照研究比較了NGS和aCGH兩種方法行PGS的臨床結(jié)果，發(fā)現(xiàn)NGS能夠100%檢測(cè)24條染色體的非整倍體現(xiàn)象，結(jié)果和公認(rèn)的aCGH結(jié)果一致；NGS法行PGS后囊胚移植妊娠率達(dá)到74.7%，胚胎種植率達(dá)70.5%，與aCGH方法沒(méi)有顯著差異[52](Ⅱ級(jí))。對(duì)aCGH、SNP array和NGS三種方法對(duì)24條染色體整倍性檢測(cè)的一致性研究顯示，通過(guò)對(duì)30個(gè)囊胚活檢結(jié)果的分析比較，發(fā)現(xiàn)這三種方法對(duì)非整倍體胚胎的檢出率均為100%，進(jìn)一步對(duì)720條染色體的分析發(fā)現(xiàn)，NGS與aCGH的一致性為99.31%，與SNP array的一致性為99.58%，均具有較高的一致性[53](Ⅲ級(jí))。

六、PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控

指南意見(jiàn)：PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控制度，并獲得PGD資格認(rèn)證。

胚胎活檢的檢出率是PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控的重要指標(biāo)。在2 586枚活檢囊胚中，明確遺傳檢測(cè)結(jié)果的有2 437枚，檢出率為94.24%；未檢出囊胚中，30枚為擴(kuò)增失敗，單細(xì)胞擴(kuò)增的失敗率為1.16%，可能與滋養(yǎng)層細(xì)胞缺失有關(guān)，也可能細(xì)胞發(fā)生了降解[54](Ⅲ級(jí))。

PGD/PGS在臨床上可以識(shí)別的錯(cuò)誤發(fā)生率較低，但誤診的臨床后果較為嚴(yán)重，導(dǎo)致受到遺傳影響的孩子出生，或者妊娠終止，因此也是PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控的重要指標(biāo)。FISH技術(shù)應(yīng)用于胚胎染色體倍性分析，有報(bào)道在30 965例PGD移植周期中出現(xiàn)19例誤診，PGD周期誤診率為0.06%[55](Ⅲ級(jí))，原因主要有探針的雜交失敗、雜交信號(hào)重疊與分離造成的判別錯(cuò)誤；PCR技術(shù)的主要風(fēng)險(xiǎn)為等位基因脫扣，有報(bào)道在7 759例PGD移植周期中出現(xiàn)12例誤診，PGD周期誤診率為0.15%[54](Ⅲ級(jí))；也有報(bào)道在以qPCR方法診斷出的4 794枚判斷為整倍體的囊胚中，移植妊娠后發(fā)現(xiàn)10例差錯(cuò)，每枚囊胚的誤診率為0.21%[56](Ⅲ級(jí))；以aCGH方法診斷出的579枚判斷為整倍體的囊胚中，移植妊娠后發(fā)現(xiàn)5例差錯(cuò)，每枚囊胚的誤診率為0.86%[57](Ⅲ級(jí))。NGS技術(shù)的測(cè)序錯(cuò)誤和假陽(yáng)性結(jié)果與測(cè)序深度有關(guān)，隨著測(cè)序深度的提升，錯(cuò)誤率下降。

因?qū)υ\斷結(jié)果的可靠性要求高，PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)技術(shù)人員實(shí)施嚴(yán)格的專項(xiàng)培訓(xùn)，強(qiáng)化安全教育和操作流程的監(jiān)督。同時(shí)，PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有內(nèi)部質(zhì)控，并盡可能通過(guò)外部認(rèn)證。

內(nèi)部質(zhì)控的目的是維持實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的穩(wěn)定性。PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立嚴(yán)格的內(nèi)部質(zhì)控制度，做好質(zhì)控記錄、差錯(cuò)記錄的管理，并定期組織監(jiān)督，檢查質(zhì)控制度落實(shí)情況。定期對(duì)技術(shù)操作結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，計(jì)算胚胎活檢中細(xì)胞損傷的比例、未得到診斷結(jié)果的細(xì)胞比例。以1年數(shù)據(jù)為依據(jù)，利用未移植胚胎復(fù)查計(jì)算誤診率。

外部認(rèn)證是質(zhì)量保障體系的最高標(biāo)準(zhǔn)。PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量的外部認(rèn)證目前尚缺少質(zhì)量認(rèn)證的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。ESHRE PGD聯(lián)盟推薦PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室采用ISO 15189或同等級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)，并參加所在國(guó)家的PGD資格認(rèn)證[4](Ⅴ級(jí))。質(zhì)控方法參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)“高通量基因測(cè)序植入前胚胎遺傳學(xué)診斷和篩查技術(shù)規(guī)范(試行)”[8]。

總 結(jié)

1.PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室管理上，強(qiáng)力推薦建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程，在有效的質(zhì)量管理體系下，建立成熟穩(wěn)定的遺傳檢測(cè)相關(guān)技術(shù)，拓展PGD/PGS技術(shù)臨床應(yīng)用的廣度、深度和精度，改善分娩結(jié)局。

2.授精方式強(qiáng)力推薦采用ICSI方式，以避免親源遺傳物質(zhì)的污染。胚胎培養(yǎng)強(qiáng)力推薦采用單滴培養(yǎng)方式，以確保胚胎和活檢材料、活檢結(jié)果一一對(duì)應(yīng)。

3.胚胎活檢的時(shí)機(jī)強(qiáng)力推薦囊胚期滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢。透明帶打孔的方法強(qiáng)力推薦激光法。活檢方法推薦采用激光或機(jī)械切割法。滋養(yǎng)層細(xì)胞達(dá)到A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)推薦活檢6個(gè)以上細(xì)胞，達(dá)不到A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)推薦活檢3～6個(gè)細(xì)胞。

4.活檢胚胎推薦采用玻璃化冷凍方法保存。

5.染色體疾病的遺傳學(xué)檢測(cè)可采用芯片類或者NGS檢測(cè)方法，單基因病檢測(cè)可采用基因的PCR擴(kuò)增和/或測(cè)序技術(shù)，對(duì)突變位點(diǎn)檢測(cè)同時(shí)在其附近尋找分子標(biāo)記做連鎖分析，降低PCR方法的誤診率。

6.推薦PGD/PGS實(shí)驗(yàn)室建立內(nèi)部質(zhì)控，并盡可能通過(guò)外部認(rèn)證，保障檢出率，降低誤診率。