趙亮，張蕾，孫麗芳，王穎，于麗，鄭秀麗，劉靜芳，鄭蓉

(1.北京積水潭醫(yī)院，北京 100035；2.北京清華長庚醫(yī)院，北京 102218；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院，北京 100191；4.北京大學(xué)北大醫(yī)院，北京 100034)

輔助生殖技術(shù)(ART)安全性一直廣受關(guān)注，流行病學(xué)調(diào)查顯示，即使經(jīng)過混雜因素的調(diào)整，輔助生殖圍產(chǎn)期合并癥發(fā)病率高于普通人群，其病理生理機制與胎盤發(fā)育不良有關(guān)，表現(xiàn)為胎盤滋養(yǎng)層細胞侵襲能力下降，對子宮螺旋動脈重塑不足[1]。類似地，在幾種動物模型中，IVF-ET比自然受孕存在高發(fā)病率的胎盤滋養(yǎng)層細胞功能異常[2]。絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，在細胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具有重要作用，參與細胞分化、發(fā)育、分裂等多種生理功能，對胎盤滋養(yǎng)層細胞的黏附、侵襲功能起關(guān)鍵作用[3]。本研究排除不孕因素后，以自然妊娠為對照，對IVF-ET來源的早期胎盤絨毛組織進行基因芯片研究，探討IVF-ET技術(shù)對早期胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路的功能影響，以尋找表達差異的基因和調(diào)控機制，從胎盤早期發(fā)育視角初步探討輔助生殖安全性以及可能的病理生理機制。

資料與方法

一、研究對象

選取2014～2017年在北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET治療并行雙胚胎移植的28例孕婦作為研究組(IVF-ET組)，同期在醫(yī)院計劃生育手術(shù)室行雙胎妊娠人工流產(chǎn)的8例孕婦作為對照組。研究組入選標(biāo)準(zhǔn)為：年齡30～35歲，因輸卵管因素接受IVF-ET治療后雙胚胎移植，雙絨毛膜雙胎，妊娠7～8周超聲引導(dǎo)下減為單胎(因高血壓、子宮畸形等客觀因素或患者要求進行減胎)，剩余胚胎妊娠經(jīng)過正常，無妊娠并發(fā)癥及出生缺陷。臨床資料通過北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖中心數(shù)據(jù)庫收集。對照組收集同期年齡相當(dāng)、孕齡相當(dāng)，流產(chǎn)前經(jīng)B超確認絨毛膜性的自然妊娠雙絨毛膜雙胎，人工流產(chǎn)采用物理方法擴張宮頸管，不使用前列腺素藥物。本研究方案和標(biāo)本獲取均經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會審核通過，兩組孕婦均簽署知情同意書。

二、實驗方法

1.胎盤絨毛收集：IVF-ET組標(biāo)本獲?。夯颊吲趴瞻螂?，采用膀胱截石體位，常規(guī)消毒鋪巾，采用穿刺針導(dǎo)架的無菌探頭套陰道探頭，檢查孕囊數(shù)量、位置，使用16G雙腔穿刺針，超聲引導(dǎo)下穿刺陰道及子宮壁，刺入目標(biāo)胚胎，用20 ml注射器抽吸胚胎，吸出胚胎組織或目標(biāo)胚胎胎心搏動消失，在穿刺針退出的時候，在胚胎和子宮內(nèi)膜交界處吸取胎盤絨毛組織。立即置于熱臺倒置顯微鏡下純化胎盤絨毛，送少量絨毛組織到細胞遺傳實驗室進行核型檢測，絨毛染色體正常的組織進行后續(xù)研究。對照組收集的人工流產(chǎn)絨毛組織進行同樣的純化及核型檢測。

2.胎盤絨毛RNA提?。河杀本┎W生物有限公司完成絨毛組織勻漿，使用Macherey Nagel NucleoSpin RNAⅡkit試劑盒(迪倫，德國)完成RNA提取及后續(xù)基因芯片檢測。對總RNA進行質(zhì)量檢驗，核糖體28S和18S RNA比值為1.0～1.5∶1之間，符合研究質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.基因芯片分析：采用等量胎盤絨毛總RNA(2 μg)合成雙鏈cDNA，MessageAmpⅡaRNA Amplification Kit(Ambion，美國)生物素標(biāo)記獲得cRNA。按照Affymetrix基因芯片方法指南將cRNA片段化，生成35～200 bp的cRNA。采用美國Affymetrix公司U133 plus 2.0芯片，芯片雜交爐640在45℃下旋轉(zhuǎn)雜交16 h，基因芯片射流站450對芯片進行洗滌、染色(鏈霉親和藻紅蛋白)，掃描儀3000和GCOS1.4分析基因芯片結(jié)果(上述儀器均購自美國Affymetrix公司)。采用二分類、非配對方法，Significance Analysis of Microarrays SAM version 3.02軟件進行結(jié)果統(tǒng)計和分析，篩選差異表達基因。采用無監(jiān)督聚類軟件Cluster 3.0 & TreeView對差異表達基因制圖分析。

4.實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測：qRT-PCR方法驗證基因芯片結(jié)果。選擇MAPK信號通路中8個差異基因進行驗證。RNA來自基因芯片檢測及組內(nèi)所有標(biāo)本(IVF-ET組28例，對照組8例)。第一鏈互補合成反應(yīng)采用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物，大連)。qRT-PCR儀PRISM7300(ABI，美國)進行擴增反應(yīng)，GAPDH內(nèi)參，qRT-PCR檢測引物詳見表1。每個qRT-PCR反應(yīng)設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，結(jié)果分析采用DDCt方法。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

表1 qRT-PCR引物序列和擴增長度

結(jié) 果

一、胎盤滋養(yǎng)層細胞基因表達譜芯片結(jié)果

IVF-ET組與對照組的病例資料特點見表2(每組各4例，均滿足統(tǒng)計學(xué)要求)。SAM軟件分析發(fā)現(xiàn)，在妊娠7周胎盤絨毛組織中，IVF-ET組與對照組在MAPK信號通路中共有32個差異基因表達(差異表達倍數(shù)≥2倍)，13個基因表達上調(diào)，19個基因表達下調(diào)，詳見熱圖(圖1)和散點圖(圖2)。利用無監(jiān)督聚類軟件對胎盤絨毛組織差異表達基因進行分析，結(jié)果以TreeView顯示，8例樣本被聚為兩大類，可見與IVF-ET組胎盤絨毛組織和對照組的區(qū)分完全一致，差異明顯，見圖3。

表2 基因芯片病例資料

二、差異基因名稱以及Ontology功能分析

IVF-ET組與對照組共有32個差異基因表達(差異表達倍數(shù)≥2倍)，其中13個基因上調(diào)，19個基因下調(diào)，這些差異基因的名稱、生物功能和染色體定位等分析見表3。

IVF-ET組與對照組胎盤絨毛組織中MAPK信號通路基因成員的差異表達情況，紅色代表基因表達上調(diào)，綠色代表基因表達下調(diào)圖1 熱圖

IVF-ET組與對照組胎盤絨毛組織中MAPK信號通路基因成員的差異表達情況，Up(紅色)代表基因表達上調(diào)，Down(綠色)代表基因表達下調(diào)，X和Y軸分別以熒光信號強度為坐標(biāo)軸，每一個點代表一個基因熒光信號強度圖2 散點圖

無監(jiān)督聚類分析顯示IVF-ET組與對照組胎盤絨毛組織中MAPK信號通路基因成員的差異表達，粉色代表IVF-ET組，綠色代表對照組圖3 無監(jiān)督聚類分析

基因基因編碼基因名稱基因生物過程基因細胞組份染色體定位表達倍數(shù)q值PLA2G12B231009_at磷脂酶A2,組XIIB脂質(zhì)分解代謝過程細胞外區(qū)域chr10q22.112.280JUN201466_s_atJun原癌基因血管生成激活核染色體chr1p32-p319.690RPS6KA3226335_at核糖體蛋白S6激酶,90 kDa,多肽3骨架系統(tǒng)開發(fā)核chrXp22.2-p22.18.230ACVR1B213198_at活化素A受體,IB型有絲分裂細胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換質(zhì)膜chr12q138.080FGF18231382_at成纖維細胞生長因子18骨化,血管生成細胞外區(qū)域chr5q346.860.01PRKACB202741_at蛋白激酶,cAMP依賴性,催化性β碳水化合物代謝過程,葡萄糖代謝過程核chr1p31.15.130RASGRP3205801_s_atRAS脒釋放蛋白3(鈣和DAG調(diào)節(jié))MAPK級聯(lián)細胞內(nèi),細胞質(zhì)chr2p25.1-p24.14.500PLA2G4A210145_at磷脂酶A2,IVA組(胞質(zhì),鈣依賴性)卵巢卵泡排卵,黃體分解膜分數(shù)chr1q254.080.01FGFR4204579_at成纖維細胞生長因子受體4器官誘導(dǎo)細胞外區(qū)域chr5q35.1-qter3.820.01PDGFRA203131_at血小板衍生的生長因子受體,α多肽黃體化核chr4q123.700.01CACNB2213714_at鈣通道,電壓依賴性,beta 2亞基運輸質(zhì)膜chr10p123.600RPS6KA2212912_at核糖體蛋白S6激酶,90 kDa,多肽2有絲分裂中期核chr6q273.570SOS1227426_at鳥苷酸交換因子1(果蠅)凋亡過程細胞內(nèi)chr2p213.550STK41569791_at絲氨酸/蘇氨酸激酶4細胞形態(tài)發(fā)生核chr20q11.2-q13.20.440.01GNG12212294_at鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)γ12能量儲備代謝過程異三聚體G蛋白復(fù)合物chr1p31.30.480MAPK9210570_x_at絲裂原活化蛋白激酶9MAPK級聯(lián)核chr5q350.340DUSP16224832_at雙特異性磷酸酶16MAPK活性的失活核chr12p130.440.01IL1R2211372_s_at白細胞介素1受體Ⅱ型免疫反應(yīng)細胞外區(qū)域chr2q120.290MAP3K8235421_at絲裂原活化蛋白激酶激酶8MAPK級聯(lián)細胞質(zhì)chr10p11.230.290BRAF236402_atv-raf鼠肉瘤病毒致癌基因同系物B1MAPK級聯(lián)膜分數(shù)chr7q340.390STK3211078_s_at絲氨酸/蘇氨酸激酶3神經(jīng)管形成核chr8q22.20.230HSPA2211538_s_at熱休克70 kDa蛋白2對壓力的回應(yīng)細胞表面chr14q24.10.230HSPB1201841_s_at熱休克27 kDa蛋白1血管生成蛋白酶體復(fù)合物chr7q11.230.210DUSP4204015_s_at雙特異性磷酸酶4MAPK級聯(lián)可溶性部分chr8p12-p110.170EGFR224999_at表皮生長因子受體MAPK級聯(lián)高爾基膜chr7p120.240.01IL1R1215561_s_at白細胞介素1受體I型免疫反應(yīng)細胞外區(qū)域chr2q120.310.01TGFB1203085_s_at轉(zhuǎn)化生長因子β1蛋白質(zhì)進入細胞核,易位細胞外區(qū)域chr19q13.10.140RASA1202677_atRAS p21蛋白激活劑(GTPase激活蛋白)1胞質(zhì)分裂細胞內(nèi)chr5q13.30.120RPS6KA5204635_at核糖體蛋白S6激酶,90 kDa多肽5細胞因子產(chǎn)生的負調(diào)控核chr14q31-q32.10.110GADD45G204121_at生長停滯和DNA損傷誘導(dǎo)的γ激活MAPKKK活性核chr9q22.1-q22.20.090PLA2G2A203649_s_at磷脂酶A2,IIA族(血小板,滑液)磷脂代謝過程細胞外區(qū)域chr1p350.070DUSP5209457_at雙特異性磷酸酶5MAPK活性的失活核chr10q250.060

注：基因信息注釋來源：http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/；http：∥www.geneontology.org/;紅色代表表達上調(diào)基因，綠色代表表達下調(diào)的基因

三、qRT-PCR驗證胎盤MAPK信號通路部分基因成員mRNA的差異表達情況

采用qRT-PCR驗證基因芯片檢測結(jié)果，見圖4。結(jié)果分別以GAPDH為對照，與對照組相比，來源于 IVF-ET組的胎盤絨毛組織中，JUN、PLA2G4A、PDGFRA和SOS1基因表達顯著上調(diào)(P均<0.05)，MAPK9、EGFR、TGFB1和GADD45G基因表達顯著下調(diào)(P均<0.05)，qRT-PCR結(jié)果和基因芯片的檢測結(jié)果相一致，說明基因芯片的結(jié)果具有很高的可信度。

qRT-PCR驗證表達基因芯片MAPK信號通路的8個基因 JUN、PLA2G4A、PDGFRA、SOS1、MAPK9、EGFR、TGFB1和GADD45G的表達。紅色柱子顯示上調(diào)基因 mRNA的表達，綠色柱子顯示下調(diào)基因mRNA的表達，藍色柱子顯示對照組的基因mRNA的表達，相互比較,*P<0.05，**P<0.01圖4 qRT-PCR比較IVF-ET組和對照組胎盤MAPK信號通路基因成員mRNA差異表達情況

四、IVF-ET技術(shù)影響胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路成員基因的表達

IVF-ET技術(shù)對胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路成員基因表達的影響。圖5顯示差異表達基因的名稱以及在MAPK信號通路中的位置和相互調(diào)節(jié)關(guān)系?？梢奍VF-ET技術(shù)影響MAPK信號通路上游基因的表達，胎盤滋養(yǎng)層細胞通過基因差異表達的代償作用，以基本保證MAPK信號通路行駛基本功能。

IVF-ET技術(shù)對胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路成員基因表達的影響，顯示MAPK信號通路中基因表達的變化及所處的位置和相互調(diào)節(jié)關(guān)系，紅色代表基因表達上調(diào)，綠色代表基因表達下調(diào)圖5 輔助生殖技術(shù)對MAPK信號通路基因表達影響

討 論

胎盤滋養(yǎng)細胞是妊娠過程中最活躍的細胞之一，其發(fā)育和侵襲過程受到時間和空間的嚴(yán)格精細調(diào)控[4]，對其調(diào)節(jié)失控會導(dǎo)致各種疾病[5]。MAPK是人滋養(yǎng)層細胞內(nèi)存在的一族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[6]。各種MAPK通路完成不同的功能，傳遞細胞內(nèi)復(fù)雜信號，最后表現(xiàn)為細胞的行為發(fā)生改變[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路血小板衍生生長因子受體α多肽(PDGFRA)基因高表達。PDGFRA主要參與MAPK的蛋白激酶(ERK)信號通路，在表皮生長因子(EGF)和血小板生長因子(PDGF)的刺激下，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞對生長因子、應(yīng)激刺激、細菌產(chǎn)物和炎癥介質(zhì)的細胞反應(yīng)[8]，這表明IVF-ET技術(shù)本身存在應(yīng)激、細菌感染和炎癥介質(zhì)等可能，相比較自然妊娠，IVF-ET一定程度激活MAPK的ERK信號通路。本研究中，IVF-ET胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路原癌基因(JUN)表達上調(diào)，見表3和圖4，JUN主要參與MAPK的JNK信號通路，該信號通路主要被生長因子、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)、紫外線、射線、熱休克、細胞外高滲及DNA變性劑等激活[9]。IVF-ET來源的JUN高表達，顯示MAPK的JNK信號通路激活，轉(zhuǎn)而磷酸化轉(zhuǎn)錄因子C-JUN的氨基末端特定位點，C-JUN是序列特異性轉(zhuǎn)錄激活因子激活蛋白1(AP-1)的成分之一，磷酸化的C-JUN通過誘導(dǎo)同源或異源二聚體形成，與AP-1位點的順式作用元件結(jié)合而啟動某些效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路熱休克蛋白1(HSPB1)和熱休克蛋白2(HSPA2)低表達，見圖1和表3。HSPB1和HSPA2主要參與MAPK的p38信號通路，熱休克、紫外線照射、細菌成分、IL-3和促紅細胞生成素(EPO)均能激活這條通路[11]，p38主要散在分布滋養(yǎng)層細胞的胞漿，受到熱休克等刺激后，p38被激活并轉(zhuǎn)移到細胞核，能激活滋養(yǎng)層細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子激活轉(zhuǎn)錄因子2(ATF2)、C/EBP同源蛋白10(CHOP10)、肌細胞增強因子2C(MEF2C)，通過轉(zhuǎn)錄因子磷酸化來調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞目的基因的轉(zhuǎn)錄表達是MAPK信號通路的重要功能[12]。p38還能激活滋養(yǎng)層細胞內(nèi)的一些蛋白激酶，包括MAPK激活蛋白激酶2和3(MAPKAPK2和3)和p38調(diào)節(jié)/激活蛋白激酶2和3(PRAK)[13]，這些絲氨酸/蘇氨酸家族成員被磷酸化激活后，進一步激活低分子量熱休克蛋白(HSP27)，介導(dǎo)滋養(yǎng)層細胞骨架的重構(gòu)，進而參與滋養(yǎng)層細胞的應(yīng)激反應(yīng)[14]，p38亞族不同激酶可以轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)特定部位而發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能。

IVF-ET胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路Hspb1和Hspa2表達下調(diào)，顯示一種滋養(yǎng)層細胞保護性代償，代償過度表達MAPK信號通路刺激因子。本研究中也發(fā)現(xiàn)，IVF-ET胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路生長阻滯和DNA損傷基因(GADD45a)表達下調(diào)，見圖1、圖4和表3。GADD45a不僅在滋養(yǎng)層細胞DNA損傷修復(fù)及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到級聯(lián)橋梁作用，也是參與p38 MAPK和線粒體介導(dǎo)的重要凋亡誘導(dǎo)基因[15]。同時GADD45a通過p38 MAPK信號通路促進胎盤產(chǎn)生的活性分子溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1(sFlt-1)和可溶性內(nèi)皮(sEng)進入母血循環(huán)，導(dǎo)致母體血管內(nèi)皮功能障礙和滋養(yǎng)層細胞功能異常[16]。先兆子癇患者胎盤滋養(yǎng)層細胞GADD45a高表達和孕婦血清sFlt-1、sEng水平具有相關(guān)性。IVF-ET胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路GADD45a表達下調(diào)顯示一種保護性代償機制，減少MAPK信號通路過度活化，如果胎盤滋養(yǎng)層細胞缺血、缺氧和損傷超過胎盤滋養(yǎng)層細胞自身代償限度，則GADD45a表達上調(diào)，加重胎盤缺血缺氧從而產(chǎn)生更多sFlt-1、sEng，形成惡性循環(huán)導(dǎo)致先兆子癇發(fā)生[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長因子受體(EGFR)基因表達下調(diào)，表皮生長因子(EGF)作為細胞外刺激信號通過MAPK信號通路調(diào)節(jié)金屬蛋白酶(MMPs)和組織抑制劑(TIMPs)基因和蛋白表達，從而影響滋養(yǎng)層細胞的侵襲和血管重鑄[18]。

ART相關(guān)的潛在表觀遺傳風(fēng)險越來越受到關(guān)注。本文探討IVF-ET來源早期胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路基因的表達，研究結(jié)果與ART相關(guān)不良妊娠結(jié)局與異常滋養(yǎng)細胞侵襲相關(guān)的假說相一致[19]。IVF-ET技術(shù)可能影響胎盤滋養(yǎng)層細胞發(fā)育和功能，大多數(shù)情況，胎盤滋養(yǎng)層細胞通過代償作用來增加侵襲能力以及對炎癥、細菌和損傷的修復(fù)能力以及調(diào)整細胞骨架適應(yīng)滲透壓和氧化應(yīng)激，最終成功維持妊娠和正常胎兒發(fā)育[20]。同時，如果外界損傷過強，或者胎盤滋養(yǎng)層細胞代償作用不堪重負，則導(dǎo)致不同程度的不良妊娠結(jié)局，包括流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和妊娠期高血壓等[21]。我們對胎盤這種代償機制和風(fēng)險還不十分了解，胚胎可能留存妊娠期間表觀遺傳適應(yīng)機制的痕跡，加劇成年期的代謝性疾病風(fēng)險[22]。ART改變胎盤和胎兒生長的動力學(xué)可能與各種生物學(xué)途徑中的修飾有關(guān)，目前調(diào)整胎盤代償系統(tǒng)和完整網(wǎng)絡(luò)仍然模糊[23]。本研究提供IVF-ET技術(shù)早期胎盤滋養(yǎng)層細胞MAPK信號通路基因表達變化、在通路中定位以及相互的調(diào)節(jié)關(guān)系，見圖5，這有助于ART技術(shù)改善和安全性提高，以確保整個ART過程更加接近自然妊娠經(jīng)過和結(jié)局。