（山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院 外科教研室，山西 大同 037009）

甘氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。脊髓背角中甘氨酸傳遞在各種疼痛進(jìn)程中起著關(guān)鍵的作用；而鞘內(nèi)注射甘氨酸在動(dòng)物疼痛模型中具有鎮(zhèn)痛作用[1-2]。以往研究表明[3]，側(cè)腦室注射甘氨酸可通過甘氨酸受體對(duì)急性熱痛和化學(xué)傷害性刺激大鼠產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。細(xì)胞外液甘氨酸濃度受到甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（Glycine transporters,GlyT）調(diào)控，GlyT有2個(gè)亞型，GlyT1和GlyT2[4]。其中GlyT2位于脊髓甘氨酸能神經(jīng)元突觸前膜，可轉(zhuǎn)運(yùn)突觸間隙中的甘氨酸，抑制甘氨酸傳遞。最近研究表明[5]，鞘內(nèi)注射GlyT2抑制劑ALX1393對(duì)神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物模型具有鎮(zhèn)痛作用。但是GlyT2抑制劑在脊髓以上區(qū)域傷害性傳遞中的作用仍不明確。近年有研究報(bào)道[6]，GT-0198是一種結(jié)構(gòu)新穎的GlyT2抑制劑，具有很強(qiáng)的抑制GlyT2作用。因此，本研究主要觀察側(cè)腦室注射選擇性GlyT2抑制劑GT-0198對(duì)大鼠慢性壓迫損傷（chronic constriction injury,CCI）神經(jīng)病理性疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 35只雄性SD大鼠，體重200～250 g，購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（晉）2009-0001。室內(nèi)溫度保持在25℃左右，濕度在50%左右。明暗周期12 h，自由飲水和進(jìn)食。將SD大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組和CCI組。CCI組大鼠進(jìn)一步分為Sham組、Vehicle+CCI組、GT-0198（10 μg）+CCI組、GT-0198（50 μg）+CCI組、GT-0198（100 μg）+CCI組和 GT-0198（100μg）+士的寧（Strychnine,STR）（10 μg）+CCI組，每組5只大鼠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 GT-0198和STR（美國(guó)Sigma公司），腦立體定位儀（北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司），ZH-RXZ型柔性顱骨鉆（安徽正華生物儀器有限公司），冷熱板測(cè)痛儀（北京米蘭科技有限公司），Von Frey針刺觸覺測(cè)量套件（深圳沃德生命科技有限公司），熱痛刺激儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），大鼠旋轉(zhuǎn)活動(dòng)輪監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（北京拜安吉科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CCI模型復(fù)制 10%水合氯醛麻醉（150～200 mg/kg）大鼠，從大鼠左后肢大腿中后部切開皮膚，然后鈍性分離肌肉，暴露大鼠坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)三根分叉上游主干部位游離神經(jīng)7 mm左右，在距神經(jīng)起始處上方2 mm，用線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間隔約1 mm[7]。Sham組除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)，其余程序同CCI。

1.2.2 側(cè)腦室插管 在CCI模型復(fù)制同一天，把麻醉大鼠固定于立體定位儀上。剪去大鼠頭部毛發(fā)，碘伏消毒。導(dǎo)管安裝位置為：前骨縫的交點(diǎn)處即前囟沿著中骨縫向前約1.5 mm，水平離中骨縫向右約1.5 mm的位置。使立體定位儀上方鋼針的針頭對(duì)準(zhǔn)導(dǎo)管安裝位置打孔。將導(dǎo)管慢慢插入側(cè)腦室。專用膠水將導(dǎo)管固定于顱骨上，然后縫合顱骨皮膚。腹腔注射適量青霉素鈉以防止感染。在CCI手術(shù)后7 d側(cè)腦室注射各種試劑，注射量均為5 μl，且在1 min內(nèi)完成。

1.2.3 電子Von Frey檢測(cè) 主要是對(duì)大鼠縮足閾值（paw withdrawal threshold,PWT）進(jìn)行測(cè)定。Von Frey細(xì)絲（1.0～15 g）垂直刺激CCI大鼠后足中央處，持續(xù)5～10 s，出現(xiàn)明顯縮足、舔足及抬足行為為陽性反應(yīng)，重復(fù)3次，間隔5 min。

1.2.4 冷板實(shí)驗(yàn) 將CCI大鼠放置在冷板測(cè)試儀器上，冷板溫度為4℃。觀察并記錄大鼠縮足反應(yīng)潛伏期（paw withdrawal latency,PWL）。重復(fù)3次，間隔5 min，取平均值。

1.2.5 熱刺激儀檢測(cè) 采用熱痛刺激儀記錄CCI大鼠對(duì)熱刺激的PWL。為避免損傷，30 s為上限。重復(fù)3次，間隔5 min，取平均值。

1.2.6 旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn) 正常大鼠置于旋轉(zhuǎn)滾筒上，其速度為在5 min內(nèi)從4增加到40 r/min，迫使其向前走，避免跌下。記錄大鼠跌下的時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Bonferroni法，多組間比較采用方差分析和重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GT-0198在CCI大鼠機(jī)械性痛覺過敏中的作用

Vehicle+CCI組大鼠左后肢 PWT 為（15.2±3.8）g，而Sham組大鼠為（36.8±4.4）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.823，P=0.000），Vehicle+CCI組PWT降低。不同劑量GT-0198均可提高CCI大鼠PWT，經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.865，P=0.002），且呈劑量依賴性。大鼠PWT Vehicle+CCI組與不同劑量GT-0198+CCI組比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的PWT有差異（F=16.754，P=0.003）；②多組間PWT有差異（F=21.305，P=0.000），Vehicle+CCI組PWT低于不同劑量GT-0198+CCI組；③多組PWT變化趨勢(shì)有差異（F=13.964，P=0.006）。此外，GT-0198（100 μg）的效應(yīng)可被 STR（10 μg）完全逆轉(zhuǎn)。見表1和圖1。

表1 各組不同時(shí)間的PWT比較 （n=5，g，±s）

表1 各組不同時(shí)間的PWT比較 （n=5，g，±s）

0 min 30 min 60 min 120 min 180 min Sham 組 39.0±6.7 39.0±6.7 39.0±6.7 39.0±6.7 39.0±6.7 Vehicle+CCI組 14.3±4.5 13.6±4.0 15.7±5.1 16.3±5.6 15.4±5.0 GT-0198（10 μg）+CCI組 14.5±4.0 29.6±10.4 19.7±4.8 16.4±5.0 15.5±4.7 GT-0198（50 μg）+CCI組 14.4±4.1 39.5±14.8 36.3±13.6 33.8±12.4 27.3±11.8 GT-0198（100 μg）+CCI組 14.3±4.3 39.4±15.0 32.5±12.7 15.7±6.2 15.2±6.6 GT-0198（100 μg）+STR（10 μg）+CCI組 14.6±4.2 19.7±5.4 19.4±5.1 18.6±4.7 16.9±4.3組別

圖1 側(cè)腦室注射GT-0198對(duì)CCI大鼠機(jī)械性痛覺過敏的影響

2.2 GT-0198在CCI大鼠冷痛覺過敏中的作用

Sham組大鼠在觀察期內(nèi)未出現(xiàn)肢體移動(dòng)和晃動(dòng)，而Vehicle+CCI組大鼠基線后肢PWL為（30.3±8.8）s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.247，P=0.000），Vehicle+CCI組大鼠PWL降低。不同劑量GT-0198均可延長(zhǎng)CCI大鼠PWL，經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.632，P=0.004），且呈劑量依賴性。大鼠PWL Vehicle+CCI組與不同劑量GT-0198+CCI組比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的PWL有差異（F=19.073，P=0.001）；②多組PWL有差異（F=25.624，P=0.000），Vehicle+CCI組PWL短于不同劑量GT-0198+CCI組；③多組PWL變化趨勢(shì)有差異（F=12.861，P=0.007）。此外，GT-0198（100μg）的效應(yīng)可被STR（10 μg）完全逆轉(zhuǎn)。見表2和圖2。

2.3 GT-0198在CCI大鼠熱痛覺過敏中的作用

Vehicle+CCI組大鼠基線后肢 PWL 為（6.0±0.8）s，而Sham組大鼠PWL是（9.8±1.1）s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.729，P=0.000），Vehicle+CCI組大鼠PWL縮短。不同劑量GT-0198對(duì)CCI大鼠PWL均無顯著影響（F=6.042，P=0.067）。大鼠 PWL Vehicle+CCI組與不同劑量GT-0198+CCI組比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的PWL無差異（F=5.847，P=0.074）；②多組 PWL無差異（F=3.305，P=0.153）；③多組PWL變化趨勢(shì)無差異（F=4.971，P=0.087）。見表3和圖3。

表2 各組不同時(shí)間的PWL比較 （n=5，s，±s）

表2 各組不同時(shí)間的PWL比較 （n=5，s，±s）

0 min 30 min 60 min 120 min 180 min Sham 組 180.0±0.0 180.0±0.0 180.0±0.0 180.0±0.0 180.0±0.0 Vehicle+CCI組 30.6±14.4 29.3±15.0 28.7±15.3 30.3±15.6 29.4±15.2 GT-0198（10 μg）+CCI組 30.5±15.0 102.6±19.4 56.7±16.8 40.4±17.3 39.5±17.5 GT-0198（50 μg）+CCI組 30.4±14.2 165.6±21.8 176.3±20.7 118.8±18.6 59.5±17.0 GT-0198（100 μg）+CCI組 30.7±14.3 178.4±22.3 179.5±22.0 136.7±19.7 90.6±18.4 GT-0198（100 μg）+STR（10 μg）+CCI組 30.0±13.9 40.7±15.2 39.1±14.1 38.6±14.5 37.9±14.3組別

圖2 側(cè)腦室注射GT-0198對(duì)CCI大鼠冷痛覺過敏的影響 （n=5）

圖3 側(cè)腦室注射GT-0198對(duì)CCI大鼠熱痛覺過敏的影響

表3 各組不同時(shí)間的PWL比較 （n=5，s，±s）

表3 各組不同時(shí)間的PWL比較 （n=5，s，±s）

0 min 30 min 60 min 120 min 180 min Sham 組 9.4±1.3 9.4±1.3 9.4±1.3 9.4±1.3 9.4±1.3 Vehicle+CCI組 5.9±0.5 5.6±0.4 6.0±0.5 6.1±0.6 6.2±0.6 GT-0198（10 μg）+CCI組 5.9±0.4 5.7±0.5 6.1±0.4 6.4±0.6 6.5±0.7 GT-0198（50 μg）+CCI組 5.9±0.4 6.3±0.8 6.2±0.6 6.6±0.5 6.6±0.6 GT-0198（100 μg）+CCI組 5.9±0.5 6.4±0.6 6.5±0.7 7.1±0.6 6.8±0.6 GT-0198（100 μg）+STR 組（10 μg）+CCI組 5.8±0.5 5.7±0.4 6.0±0.5 6.2±0.7 6.1±0.5組別

圖4 側(cè)腦室注射GT-0198對(duì)正常大鼠旋轉(zhuǎn)功能的影響

2.4 GT-0198對(duì)正常大鼠運(yùn)動(dòng)功能的影響

Vehicle+CCI組大鼠基線旋轉(zhuǎn)潛伏期是（108±12）s。不同劑量GT-0198對(duì)正常大鼠旋轉(zhuǎn)潛伏期均無顯著影響（F=7.184，P=0.059）。大鼠旋轉(zhuǎn)潛伏期Vehicle+CCI組與不同劑量GT-0198+CCI組比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的旋轉(zhuǎn)潛伏期無差異（F=3.769，P=0.145）；②多組旋轉(zhuǎn)潛伏期無差異（F=4.735，P=0.097）；③多組旋轉(zhuǎn)潛伏期變化趨勢(shì)無差異（F=2.086，P=0.262）。見表4和圖4。

表4 各組不同時(shí)間的大鼠旋轉(zhuǎn)功能比較 （n=5，±s）

表4 各組不同時(shí)間的大鼠旋轉(zhuǎn)功能比較 （n=5，±s）

組別 0 min 30 min 60 min 120 min Vehicle+CCI組 110.3±14.6 108.5±15.7 109.1±15.3 110.8±15.6 GT-0198（10 μg）+CCI組 109.5±15.1 107.6±14.6 108.7±16.4 109.4±15.3 GT-0198（50 μg）+CCI組 109.4±14.8 106.5±14.7 108.5±13.9 108.9±14.7 GT-0198（100 μg）+CCI組 103.3±14.5 90.4±13.1 92.5±12.8 98.7±13.2

3 討論

GlyT2在脊髓及脊髓上的甘氨酸能在神經(jīng)元中表達(dá)，在抑制甘氨酸傳遞調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[8]。選擇性GlyT2抑制劑可能是一種新型的鎮(zhèn)痛藥物，可緩解不同類型的疼痛。全身或鞘內(nèi)注射GlyT2抑制劑對(duì)急性、持續(xù)性和慢性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用[9]。但是GlyT2抑制劑在脊髓以上中樞區(qū)域傷害性傳遞中的作用仍不明確。

GT-0198劑量依賴性抑制CCI大鼠機(jī)械和冷痛覺過敏，但對(duì)熱痛覺過敏無影響。盡管甘氨酸在不同疼痛模型中傳遞方式不一樣，但不同疼痛模型中的鎮(zhèn)痛效應(yīng)仍不能完全解釋。為了確認(rèn)GT-0198介導(dǎo)的抗痛覺過敏是通過抑制脊髓上GlyT2及活化的甘氨酸受體，因而側(cè)腦室預(yù)先注射甘氨酸受體拮抗劑STR。結(jié)果顯示，STR可完全逆轉(zhuǎn)GT-0198對(duì)CCI大鼠機(jī)械和冷痛覺過敏的影響。GT-0198是通過增強(qiáng)甘氨酸能傳遞而發(fā)揮作用的。脊髓上GT-0198的作用機(jī)制可能是激活疼痛抑制系統(tǒng)。延髓頭端腹內(nèi)側(cè)髓質(zhì)的甘氨酸神經(jīng)元直接投射到脊髓，有助于脊髓傷害性刺激的抑制[10]。外源甘氨酸注入丘腦腹側(cè)基底可減少軀體感覺神經(jīng)元放電，而聯(lián)合應(yīng)用STR可拮抗該作用[11]。上述結(jié)果表明，通過GT-0198增加丘腦甘氨酸水平可抑制傷害性傳遞。但是目前仍不明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他區(qū)域GlyT2表達(dá)是否與GT-0198鎮(zhèn)痛作用相關(guān)。同時(shí)在大腦特定區(qū)域GlyT1抑制劑也可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。GlyT1抑制劑（肌氨酸），注入到前額葉皮層可減少神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型損傷足的機(jī)械敏感性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，雖然甘氨酸神經(jīng)元在控制脊髓運(yùn)動(dòng)功能方面發(fā)揮重要的作用，但它們?cè)诖竽X中的作用仍不明確。側(cè)腦室注射甘氨酸不影響動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)功能[13]。GlyT2在脊髓中樞的生理作用仍不清楚。下丘腦室旁核微量注射甘氨酸可引起心率減慢，尿量增加等，而STR可抑制上述反應(yīng)[14]。下丘腦中GlyT2抑制劑可能對(duì)心血管和腎臟有影響。要明確GlyT2生理作用以及GlyT2抑制劑的藥理作用，需要GT-0198注射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特定區(qū)域。

綜上所述，腦室注射選擇性GlyT2抑制劑GT-0198可減輕CCI大鼠模型機(jī)械和冷痛覺過敏，而且對(duì)正常大鼠運(yùn)動(dòng)功能無影響。