陳衛(wèi)鋒，徐升運(yùn)，秦濤，趙文娟，李文孝

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，西安 710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，西安 710043)

沙棘是一種多年生的灌木，屬于胡頹子科(Elaeagnaceae)，沙棘屬(HippophaeLinn)。沙棘具有良好的生態(tài)保護(hù)作用，比如保持水土、防風(fēng)固沙、改良土壤和適應(yīng)性強(qiáng)等，同時沙棘含有豐富的生物活性物質(zhì)如氨基酸、脂肪酸、黃酮等，因此，沙棘具有較高的營養(yǎng)和藥用價值[1]。蕎麥?zhǔn)俏覈狈街匾碾s糧作物之一，其微量元素和黃酮類等活性物質(zhì)含量豐富[2]。以沙棘和蕎麥為原料，輔以現(xiàn)代生物技術(shù)(酶工程的應(yīng)用)生產(chǎn)沙棘蕎麥醋，既保證了兩種原料中的營養(yǎng)成分完全釋放，又有效利用了兩種原料各自的優(yōu)點。我國雖然已經(jīng)有蕎麥醋的釀造，但是利用沙棘稈、沙棘果皮為輔料釀造沙棘蕎麥醋還未見報道，本研究以蕎麥粉為碳源，利用酶工程技術(shù)以及發(fā)酵技術(shù)將其中的淀粉轉(zhuǎn)化為醋酸的同時，又利用酶工程技術(shù)對沙棘輔料進(jìn)行破壁，使其中的活性保健成分最大程度地釋放，釀造出具有較高保健功能的功能型食醋。本文對釀造工藝中的酶工程技術(shù)以及釀造工藝進(jìn)行了探索，并確定了基本工藝參數(shù)，為沙棘蕎麥醋的產(chǎn)業(yè)化提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌種

釀酒酵母：購自安琪集團(tuán)；醋酸菌：購自廣東省微生物研究所。

1.2 材料

沙棘原料：包括沙棘稈、沙棘果皮、沙棘果泥、沙棘果汁，由陜西省延安市吳起縣園方集團(tuán)提供；蕎麥粉：購自陜西省定邊縣；纖維素酶：陜西省生物農(nóng)業(yè)所生產(chǎn)；糖化酶：購自山東濟(jì)寧和美生物工程有限公司；果膠酶：天津諾奧科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基；醋酸菌菌種培養(yǎng)基。

1.4 主要儀器

恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、細(xì)胞破碎儀、721紫外分光光度計等。

1.5 分析方法

總酸(以醋酸計)含量的測定：GB/T 12456-2008[3]。

淀粉含量的測定：GB 5009.9-2016《食品中淀粉的測定》[4]。

還原糖含量的測定：GB 5009.7-2016 《食品中還原糖的測定》[5]。

總黃酮含量的測定：紫外分光光度法[6]。

2 工藝參數(shù)確定的試驗方法

2.1 工藝流程

利用酶法糖化，改變傳統(tǒng)的小酒母發(fā)酵制作酒曲的方法。在利用沙棘輔料時加入纖維素酶和果膠酶，有助于有效活性成分的釋放。工藝流程圖見圖1。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram

2.2 糖化工藝的優(yōu)化

稱取100 g蕎麥粉置于500 mL三角瓶內(nèi)，定量加入水，調(diào)節(jié)pH值，加入糖化酶，保溫糖化。以淀粉含量和還原糖含量計算水解率，考察最佳糖化條件。根據(jù)糖化條件的單因素試驗結(jié)果，以糖化酶用量、處理溫度、處理時間作為考察因素，設(shè)計L9(33)正交優(yōu)化試驗，從而獲得最佳糖化工藝。

2.3 沙棘原料酶處理條件的優(yōu)化

沙棘原料包括：沙棘稈、沙棘葉、沙棘果皮、沙棘果泥、沙棘果汁。針對這些沙棘原料主要成分，選擇對應(yīng)的水解酶進(jìn)行酶處理，達(dá)到沙棘原料中沙棘黃酮以及沙棘多糖和一些沙棘特有維生素和微量元素充分釋放的目的，以期提高沙棘蕎麥醋的營養(yǎng)保健功效。

本試驗采用纖維素酶、果膠酶進(jìn)行酶解處理。以酶解溫度、酶解pH、酶用量和酶作用時間作為單因素，研究這4個因素對沙棘黃酮含量的影響，在酶作用單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(34)正交試驗，從而獲得酶處理沙棘原料的最佳工藝參數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 糖化條件的優(yōu)化結(jié)果

分別選取糖化酶酶解溫度、酶解時間、加酶量這3個因素及其對應(yīng)的3個較優(yōu)水平進(jìn)行正交試驗，在酶液pH為6.0的條件下，用正交試驗對酶解工藝條件做進(jìn)一步優(yōu)化，正交試驗結(jié)果見表1。

表1 糖化酶酶解正交試驗結(jié)果Table 1 Orthogonal experiment results of saccharifying enzyme enzymolysis

由表1可知，影響蕎麥淀粉酶法水解的因素順序為：酶解溫度>酶添加量>酶解時間，最佳水解條件應(yīng)為：酶解溫度50 ℃，酶加入量20 U/g，酶解時間90 min。

3.2 沙棘原料酶處理條件優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

3.2.1 酶添加量對總黃酮得率的影響

在溫度為45 ℃，酶解時間為90 min，原料和水比例為1∶25(W/V)，酶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～0.2%時，考察酶添加量對黃酮得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酶添加量對黃酮得率的影響Fig.2 Influence of enzyme additive amount on flavonoids yield

由圖2可知，在酶濃度為0.1%～0.5%時，黃酮得率隨著酶添加量的增加而提高，當(dāng)酶添加量超過0.3%以后，黃酮得率提高不顯著，因此，最佳酶用量為0.3%。

3.2.2 酶作用時間對黃酮得率的影響

固定酶添加量為0.3%，酶作用時間為30～150 min, 其余條件同3.2.1，酶作用時間對黃酮得率的影響見圖3。

圖3 酶作用時間對黃酮得率的影響Fig.3 Influence of enzymatic time on flavonoids yield

由圖3可知，隨著酶作用時間的延長，黃酮得率不斷提高，當(dāng)酶解時間達(dá)到120 min后，黃酮得率提高不顯著。這是因為隨著酶解時間的增加，沙棘原料中細(xì)胞壁的纖維素及細(xì)胞間的果膠質(zhì)被酶降解，有利于黃酮從細(xì)胞內(nèi)溶出。

3.2.3 酶作用溫度對黃酮得率的影響

酶作用時間定為120 min，酶解溫度設(shè)為35～65 ℃，其他各條件同3.2.2。黃酮得率變化見圖4。

圖4 酶作用溫度對黃酮得率的影響Fig.4 Influence of enzymatic temperature on flavonoids yield

由圖4可知，溫度過低，不利于酶的作用發(fā)揮，溫度過高抑制酶活，50 ℃左右是該酶制劑的最適作用溫度，確定最佳溫度為50 ℃。

3.2.4 pH對黃酮得率的影響

在酶添加量、作用時間、溫度單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計pH在4.5～7.0之間，考察pH變化對黃酮得率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH對黃酮得率的影響Fig.5 Influence of pH values on flavonoids yield

由圖5可知，pH為6.0時黃酮得率最高。因為酶作用都有最適pH值，當(dāng)pH值過低或過高時都不利用酶的催化作用。

3.3 最佳工藝條件的確定

3.3.1 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計正交試驗，見表2。

表2 正交試驗設(shè)計Table 2 Orthogonal experiment design

3.3.2 正交試驗結(jié)果

以總黃酮得率為指標(biāo)，采用L9(34)來確定最佳工藝條件，見表3。

表3 正交試驗表Table 3 Orthogonal experiment table

由表3可知，酶添加量、作用時間、作用溫度和pH值對黃酮得率影響的順序為：作用溫度>酶添加量>作用時間=pH值，最佳條件應(yīng)為A2B3C2D1。綜合考慮單因素結(jié)果，確定最佳參數(shù)為：A2B2C2D2，即酶加入量為0.3%，作用時間為120 min，作用溫度為50 ℃，pH值為6.0。

沙棘黃酮的藥理作用主要有抗心肌缺血、改善心肌細(xì)胞功能、抗心律失常、改善心肌肥大、抗血栓形成、降血糖、提高免疫、抗氧化、抗癌、抗過敏、抑菌等[7]。在發(fā)酵生產(chǎn)蕎麥醋時，本研究應(yīng)用酶工程技術(shù)工藝提高了游離黃酮含量，改善了蕎麥醋的功能，釀造出具有保健功能的醋產(chǎn)品。

4 結(jié)論

在釀造沙棘蕎麥醋中蕎麥粉的糖化工藝上，影響糖化效果的因素主次為：酶解溫度、酶添加量、酶解時間，得到蕎麥粉糖化的最佳工藝條件為：酶解溫度為50 ℃，酶加入量為20 U/g，酶解時間為90 min。

復(fù)合酶作用沙棘原料的最佳工藝條件為：酶添加量0.3%，酶解時間120 min，酶作用溫度50 ℃，pH 6.0。

現(xiàn)代生物技術(shù)酶法釀造沙棘蕎麥醋，作用條件溫和，保護(hù)了沙棘、蕎麥中的營養(yǎng)物質(zhì)活性，且蕎麥與沙棘原料中的主要活性成分總黃酮的利用率提高，增強(qiáng)了沙棘蕎麥醋的保健功能，開發(fā)出了功能性食醋及醋飲產(chǎn)品，其市場前景廣闊。