吳光忠，何炯靈，黃炳文，蔣予箭*

(1.紹興至味食品有限公司，浙江 紹興 312050；2.浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，杭州 310012)

果醋是以水果為主要原料，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵釀制而成的一種營養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良的飲品，糧醋是以大米等糧食為主要原料經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵釀制而成的一種酸性調(diào)味品[1]。近幾年來，在果醋的風(fēng)味組成、醋酸發(fā)酵過程控制、固定化發(fā)酵方式及耐高酸度醋酸菌選育等方面有較多研究，相比之下，對果醋、米醋發(fā)酵產(chǎn)品的市場開發(fā)的研究就顯欠缺[2-4]。把糧醋的發(fā)酵與果醋的發(fā)酵相結(jié)合，一方面降低了果醋的生產(chǎn)成本，另一方面拓寬了糧醋的應(yīng)用市場。本實(shí)驗(yàn)以獼猴桃果汁和糯米為原料分別生產(chǎn)果酒、米酒，按一定比例將米酒、果酒混合，接種醋酸菌發(fā)酵，制得果香型米醋[5]。用氣質(zhì)聯(lián)用色譜和高效液相色譜對不同比例果酒、米酒混合發(fā)酵的果醋樣品進(jìn)行香氣成分和有機(jī)酸含量的檢測，考察不同果酒、米酒配比下發(fā)酵制得的果香型米醋的風(fēng)味特征，為開發(fā)此類新產(chǎn)品積累科學(xué)數(shù)據(jù)[6-11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯米、獼猴桃：購于超市；安琪果酒活性干酵母：湖北安琪酵母有限公司；果膠酶：江蘇銳陽生物科技有限公司；滬釀1.01醋酸菌：上海迪發(fā)生物有限公司。

甲醇為色譜級，磷酸二氫銨為分析純，草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度均大于99%。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；LC-2010A HT高效液相色譜儀 日本島津有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；ATC手持式糖度儀 南京科航實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

工藝流程圖見圖1。

圖1 工藝流程圖Fig.1 Process flow diagram

1.3.2 果醋發(fā)酵工藝

1.3.2.1 獼猴桃汁酶解

成熟獼猴桃經(jīng)過剝皮、破碎、打漿之后，加入0.08%的果膠酶[12]，在50 ℃水浴中酶解2 h，然后再將水浴溫度調(diào)至80 ℃，保持15 min，解除果膠酶的活性。冷卻至室溫后，用蔗糖或者白砂糖調(diào)糖酸比至手持式糖度儀測定讀數(shù)為20 °Bx。

1.3.2.2 酵母菌活化

用天平稱取7 g活性干酵母加入到100 mL、2%已滅過菌的葡萄糖溶液中，用38 ℃水浴鍋活化45 min，得到活化好的酵母菌。

1.3.2.3 獼猴桃汁酒精發(fā)酵

用血球計(jì)數(shù)法計(jì)算酵母菌液中的酵母數(shù)[13]，按1×107個(gè)/mL接種量計(jì)算所需酵母原液量加入到果汁中，攪勻后置于錐形瓶中并用牛皮紙封口，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約5天，當(dāng)酒精度不再上升時(shí)酒精發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2.4 醋酸發(fā)酵

大量文獻(xiàn)表明醋酸發(fā)酵的最佳酒精度為6%(V/V)[14,15]，故將獼猴桃酒和米酒的酒精度均調(diào)至6%后按照不同比例混合，接種10%的醋酸菌，置于30 ℃發(fā)酵至酸度不再上升。

1.3.3 香氣成分的測定方法

取樣品5 mL置于20 mL頂空瓶中，然后用帶有硅橡膠隔墊的瓶蓋密封。將頂空瓶放入50 ℃水浴鍋平衡30 min，然后將萃取頭插入頂空瓶中距離液面2 cm處，50 ℃下吸附30 min，取出后插入GC進(jìn)樣口，240 ℃下解吸2 min，進(jìn)行GC-MS分析。

色譜柱：DB-WAX，60 m×0.25 mm×0.5 μm(柱長×內(nèi)徑×膜厚)；進(jìn)樣口溫度：240 ℃，不分流進(jìn)樣，載氣為氦氣，恒流模式，柱流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃，保持6 min，以2 ℃/min升到140 ℃，然后以4 ℃/min升到220 ℃，保持10 min。

離子源：EI；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；質(zhì)量數(shù)掃描范圍：33～500 amu。

1.3.4 有機(jī)酸的測定方法

用電子天平準(zhǔn)確稱取草酸40 mg，蘋果酸及酒石酸各200 mg，抗壞血酸30 mg，乳酸500 mg，醋酸6000 mg，檸檬酸700 mg以及琥珀酸180 mg，用超純水定容至100 mL，混合均勻后從中吸取1,3,5,7,9 mL，分別用超純水定容到10 mL,配成不同濃度的混合標(biāo)樣，用0.45 μm有機(jī)系微孔濾膜過濾后,繪制各有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

通過前期的實(shí)驗(yàn)得到的液相色譜條件為：色譜柱：Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速： 0.5 mL/min；柱溫：25 ℃； 檢測波長：210 nm； 進(jìn)樣體積：5 μL；流動相：5 g/L磷酸二氫銨(磷酸調(diào)pH至2.5)。

將發(fā)酵好的米醋、獼猴桃醋以及用米酒、獼猴桃酒不同比例混合發(fā)酵的混合果醋在15000 r/min的條件下離心20 min后過0.45 μm微孔濾膜，進(jìn)行HPLC定量分析，每個(gè)樣品進(jìn)樣3次，取平均值。

1.3.5 感官評價(jià)方法

根據(jù)果醋感官評定規(guī)則，對純獼猴桃醋、米醋以及用不同比例混合的獼猴桃酒和米酒發(fā)酵而成的果醋進(jìn)行感官評定，感官評價(jià)員為10人(3人來自果醋釀造企業(yè)，7人來自實(shí)驗(yàn)室，都經(jīng)過相關(guān)的感官鑒定培訓(xùn))，總分為100分，每次將10名評價(jià)員的結(jié)果進(jìn)行平均，可在備注欄里寫上對該樣品的評價(jià)。由于原醋酸度較大，故在進(jìn)行滋味品嘗時(shí)先稀釋一定的、相同的倍數(shù)。自制果醋的感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 自制果醋的感官評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standards of self-made fruit vinegar

1.3.6 理化指標(biāo)測定

酒精度測定：蒸餾法；

總酸含量測定：酸堿中和滴定法；

還原糖測定：斐林試劑法。

2 結(jié)果與分析

2.1 香氣物質(zhì)檢測結(jié)果

用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析比較了稀釋到6%的獼猴桃酒、米酒混合果酒，兩者單獨(dú)發(fā)酵而成的果醋以及混合發(fā)酵產(chǎn)生的果醋的香氣成分[16]。共分離鑒定了52種香氣成分(見表2)，主要包括酸類、醇類、酯類、醛類、酮類以及酚類這6種化合物，其相對含量比較見表3。

表2 4種樣品香氣成分GC-MS分析結(jié)果Table 2 GC-MS results of aroma components of four samples

續(xù) 表

表3 各樣品香氣物質(zhì)種類及其含量比較Table 3 Comparison of aroma components and their content in various samples

由表2和表3可知，采用GC-MS在4種樣品中共鑒定出52種香氣成分，這些成分包括酸類11種、醇類12種、酯類20種、醛類3種、酮類3種、酚類3種。對于果醋來說，含量最多的為酸類香氣物質(zhì)(主要為醋酸)，相對含量依次為：純獼猴桃酒發(fā)酵醋(77.93%)>果酒米酒混合發(fā)酵果醋(58.31%)>米醋(44.85%)，其酸的種類也有所差異，依次為：混合果醋(11種)>米醋(9種)>獼猴桃醋(8種)，由此可看出混合發(fā)酵果醋的酸類香氣物質(zhì)相對含量介于獼猴桃醋和米醋之間，但酸的種類比兩者都要高，這有利于增加果醋的風(fēng)味和嗅覺感受。在醇類含量方面，相對含量和種類均為混合發(fā)酵的果醋最佳。酯類化合物主要是在發(fā)酵過程中由有機(jī)酸與醇發(fā)生酯化反應(yīng)以及微生物代謝形成的，能產(chǎn)生果香味和花香味，米醋中酯類所占比例較高，達(dá)37.6%，其中以乙酸異戊酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯含量較多，但種類是混合發(fā)酵果醋最高，有15種之多。此外，香氣成分中的醛類、酮類和酚類種類均為混合果醋>米醋>獼猴桃醋?？偟膩砜?，3種果醋的香氣成分種類數(shù)量依次為：混合果醋(43種)>米醋(33種)>獼猴桃醋(32種)。故將獼猴桃酒和米酒混合后發(fā)酵可以集合兩者的風(fēng)味，使得果醋中的香氣成分大大增加，酸味更醇厚，醇、酯類香氣物質(zhì)增加，香氣更加協(xié)調(diào)和多樣，提高果醋的品質(zhì)。

2.2 有機(jī)酸檢測結(jié)果

將發(fā)酵好的米醋、獼猴桃醋以及用米酒、獼猴桃酒按不同比例混合發(fā)酵的混合果醋分別進(jìn)樣檢測各特征性有機(jī)酸，其HPLC分析圖譜見圖2，測定的有機(jī)酸含量見表4。

圖2 等比例混合發(fā)酵果醋中有機(jī)酸HPLC分析色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of fruit vinegar fermented by equal amount of kiwi wine and rice wine

有機(jī)酸種類有機(jī)酸含量(g/dL)果酒米醋獼猴桃醋獼∶米為3∶1獼∶米為2∶1獼∶米為1∶1獼∶米為1∶2獼∶米為1∶3草酸0.01220.01130.02350.02890.02880.01970.01750.0157酒石酸0.09740.06810.16350.18340.17690.14580.14110.0913蘋果酸0.04440.0390.03870.04650.04370.03970.03720.0303抗壞血酸0.05190.00790.0310.04440.04730.03520.03120.0159乳酸0.29840.27420.05330.10190.12460.15040.16770.1991醋酸0.19094.32185.82585.43094.89445.36165.0444.6365檸檬酸0.24130.10160.48820.73860.52860.48180.36980.213琥珀酸0.0310.03810.11790.01370.09930.08250.06610.0947特征性總酸0.96754.8626.74196.58835.94366.31675.87465.2965

由圖2和表4可知，各樣品特征性總酸含量為：純獼猴桃醋>獼猴桃酒米酒(3∶1>1∶1>2∶1>1∶2>1∶3)發(fā)酵果醋>純米酒醋，說明不同比例米酒和獼猴桃酒混合后發(fā)酵生產(chǎn)的果醋中的特征性有機(jī)酸含量差異較大。其中草酸、酒石酸、蘋果酸、抗壞血酸、檸檬酸都隨著混合果酒中的獼猴桃汁含量減少而減少，且在米酒的添加量少于獼猴桃酒時(shí)這幾種酸的含量均大于純獼猴桃汁發(fā)酵，由此可看出混合果醋中這幾種特征性有機(jī)酸主要是由獼猴桃汁發(fā)酵產(chǎn)生的，而少量添加米酒(米酒所占比例少于果酒)時(shí)又可以促進(jìn)這幾種有機(jī)酸的產(chǎn)生。乳酸隨著米酒含量的增加而有所上升，說明這種有機(jī)酸大部分來源于米酒發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)生的醋酸含量為：純獼猴桃醋>獼∶米(3∶1>1∶1>1∶2>1∶3>2∶1)>純米醋，說明配比不同產(chǎn)生的醋酸含量有所不同，可能原因是不同配比產(chǎn)生的不同生長環(huán)境對于醋酸菌的生長和產(chǎn)酸能力產(chǎn)生了較大的影響。由此可以得出，在獼猴桃酒發(fā)酵時(shí)混入適量米酒可以增加非揮發(fā)性有機(jī)酸的含量，從而增加果醋的風(fēng)味。

2.3 不同比例混合發(fā)酵果醋感官評價(jià)結(jié)果

將獼猴桃酒和米酒以不同比例混合進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生的果醋從色澤、香氣、滋味和形態(tài)這4個(gè)方面進(jìn)行感官評價(jià)，由10名評價(jià)員進(jìn)行打分，總分以各項(xiàng)平均分計(jì)，結(jié)果見表5。

表5 不同比例混合發(fā)酵的果醋感官評價(jià)結(jié)果Table 5 Results of sensory evaluation of fruit vinegar mixed with different proportions

由表5可知，當(dāng)獼猴桃酒和米酒的混合比例不同時(shí)，其發(fā)酵產(chǎn)生的果醋的風(fēng)味也有所不同。從色澤和形態(tài)方面來看，純獼猴桃汁發(fā)酵的果醋色澤亮度較好，澄清度高，而當(dāng)米酒的加入量過多時(shí)，會使得果醋的色澤變得較為暗淡，但適量地加入米酒可以使果醋的色澤呈現(xiàn)較好看的琥珀色。從香氣方面來看，純獼猴桃酒發(fā)酵而成的果醋雖果香味較好，但醋酸味較刺鼻，且酯香等其他香氣成分不明顯，米酒的加入可以增加果醋的酯香等香氣成分，調(diào)和酸味，使得香氣成分更加協(xié)調(diào)，但當(dāng)米酒的加入量超過獼猴桃酒時(shí)又會使果香味顯得不足。從滋味方面來看，當(dāng)米酒的混合量不超過獼猴桃酒時(shí)，會使得發(fā)酵果醋酸味柔和，略帶甘甜，滋味較佳。從綜合評分可以看出，當(dāng)獼猴桃酒和米酒以1∶1或者2∶1混合發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生的果醋風(fēng)味最佳。

3 結(jié)論

用頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HS-SPME-GC-MS)分析比較了純獼猴桃、純米酒以及兩者混合發(fā)酵的果醋的香氣成分，共分離鑒定了52種香氣成分，主要是酸類、醇類、酯類、醛類、酮類以及酚類這6種化合物，發(fā)現(xiàn)混合發(fā)酵果醋的總的香氣成分最多，共有43種，且每種香氣成分種類均大于或等于獼猴桃和米酒單獨(dú)發(fā)酵產(chǎn)生的醋，由此可說明在獼猴桃酒發(fā)酵過程中添加米酒可以增加果醋的各方面香氣成分，使香氣更加協(xié)調(diào)多樣。

加入適量米酒可以增加除醋酸外的特征性有機(jī)酸的含量，使酸味柔和、醇厚。從感官評價(jià)分析可看出，當(dāng)獼猴桃汁和米酒的混合比例為1∶1或者2∶1時(shí)，其口感較佳，評分較高。再結(jié)合成本考慮，米酒的價(jià)格遠(yuǎn)低于獼猴桃汁，故本實(shí)驗(yàn)將最后的配比定為6%獼猴桃酒∶6%(V/V)米酒為1∶1。

綜上，將米酒作為原料加入到果醋的發(fā)酵中，可以在降低果醋生產(chǎn)成本的同時(shí)為米酒的開發(fā)利用提供新的途徑，此外，米酒的適量加入還可以增加果醋的香氣物質(zhì)種類和特征性有機(jī)酸含量，有利于改善果醋風(fēng)味，提高果醋的品質(zhì)，可以為今后果醋行業(yè)的發(fā)展提供一種新的思路和研究方向。