薛文君，商飛飛，豆海港

(1.周口職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 周口 466001；2.賀州學(xué)院 食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西 賀州 542899)

孜然，學(xué)名CuminumcyminumL.，又名孜然芹、枯茗、香旱芹等，是傘形科(Umbelliferae)孜然芹屬(CuminumL.)植物，作為一種極其重要的香辛料，其廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[1,2]。孜然籽中含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%～5%的精油，成分主要有枯茗醛、桃金娘烯醛、α-萜品烯、β-蒎烯等[3]。孜然精油具有抑菌、殺蟲、降血糖及防癌抗癌等生物活性功能。國內(nèi)對孜然精油的功能研究主要集中在抑菌、殺蟲等方面，國外則對孜然精油的藥理作用做了比較系統(tǒng)的研究[4,5]。

超聲波提取法的原理是超聲波產(chǎn)生的機械作用，使液體內(nèi)部產(chǎn)生強的沖擊波和微射流，局部出現(xiàn)高溫、高壓，產(chǎn)生多重次級效應(yīng)，從而加快體系的傳質(zhì)和傳熱速度，加速細(xì)胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴散和溶解[6]。由于超聲波輔助提取具有提取率高、活性成分損失少等優(yōu)點，目前已被廣泛應(yīng)用于動植物等天然原料中有效成分的提取[7,8]。本文以孜然為原料，采用超聲波輔助溶劑提取法，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面中的Box-Behnken試驗優(yōu)化，同時對孜然提取物的抗氧化活性進(jìn)行了初步研究，以期為孜然的開發(fā)利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

孜然籽：購于當(dāng)?shù)爻校糜?80±1)℃干燥箱中干燥6 h，經(jīng)粉碎后過篩，備用。試劑DPPH：購于美國Sigma公司；其他試劑：均為分析純試劑。

1.2 主要儀器

XFB-500小型粉碎機、XD-52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、HH-6電熱恒溫水浴鍋、KGD-1000S超聲波發(fā)生器、FA2104電子分析天平、UV-754 型分光光度計。

2 方法

2.1 單因素試驗

采用無水乙醇為提取劑，分別考察粉碎粒徑(mm)、提取時間(h)、料液比(g/mL)對孜然提取物得率的影響。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化孜然提取試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以粉碎粒徑(X1)、提取時間(X2)、料液比(X3)3個因素為自變量，以孜然提取物得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面Box-Behnken(BBD)中心組合設(shè)計，進(jìn)行3因素3水平的優(yōu)化試驗，響應(yīng)面分析因素和水平見表1。

表1 因素與水平編碼表

2.3 抗氧化能力的測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定，參考游玉明等[9]的方法，分別取100 μL不同質(zhì)量濃度的孜然提取物及對照溶液加入0.08 mg/mL的DPPH甲醇溶液100 μL，搖勻后于室溫條件下避光靜置30 min，在517 nm波長處測定光密度值。以DPPH溶液和甲醇溶液為空白，按照式(1)計算樣品對DPPH自由基的清除能力。

(1)

2.3.2 ·OH清除能力的測定[10,11]

取l mL不同濃度的孜然提取物溶液于比色管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液l mL、6 mmol/L水楊酸乙醇溶液1 mL，加入8 mmol/L的H2O2反應(yīng)，置于37 ℃水浴30 min后取出，在510 nm波長處測吸光度。以相同濃度維生素C為陽性對照，以蒸餾水做空白對照；重復(fù)試驗3次，取平均值。

(2)

式中：A1為樣品溶液+FeSO4溶液+水楊酸乙醇溶液+H2O2溶液的吸光度；A2為樣品溶液+FeSO4溶液+水楊酸乙醇溶液+無水乙醇溶液的吸光度；A3為蒸餾水+FeSO4溶液+水楊酸乙醇溶液+H2O2溶液的吸光度。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗

3.1.1 粉碎粒徑對孜然提取物得率的影響

設(shè)定提取時間為1 h、料液比為1∶15 (g/mL)，分別在粉碎粒徑0.6，0.45，0.3，0.2 mm條件下進(jìn)行提取試驗，以孜然提取物得率為指標(biāo)，研究不同粉碎粒徑對孜然提取物得率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 粉碎粒徑對孜然提取物得率的影響

由圖1可知，在相同的條件下，隨著粉碎粒徑的減少，孜然提取物得率先升高后緩慢減小，這可能是由于粒徑的降低，促進(jìn)物質(zhì)的溶出，提高了得率，但當(dāng)物料粒徑達(dá)到一定大小時，再增加物料粒徑可能使其表面能增加[12]，所以造成孜然提取物得率降低。當(dāng)粉碎粒徑為0.3 mm時，孜然提取物得率達(dá)到最大值。

3.1.2 提取時間對孜然提取物得率的影響

設(shè)定粉碎粒徑為0.3 mm、料液比為1∶15 (g/mL)，分別在提取時間0.5，1.0，1.5，2.0 h下進(jìn)行提取試驗，以孜然提取物得率為指標(biāo)，研究不同提取時間對孜然提取物得率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 提取時間對孜然提取物得率的影響

由圖2可知，在相同的條件下，隨著提取時間的延長，孜然提取物得率先升高后緩慢減低，當(dāng)提取時間為1.5 h時，孜然提取物得率達(dá)到最大值。

3.1.3 料液比對孜然提取物得率的影響

設(shè)定粉碎粒徑為0.3 mm、提取時間為1 h，按照料液比為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20 (g/mL)分別進(jìn)行提取試驗，以孜然提取物得率為指標(biāo)，研究料液比對孜然提取物得率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對孜然提取物得率的影響

由圖3可知，在相同的條件下，隨著料液比的增大，孜然提取物得率先緩慢升高后減低，當(dāng)料液比為1∶15 (g/mL)時，孜然提取物得率達(dá)到最大值。

3.2 響應(yīng)面法試驗

以孜然提取物得率為考核指標(biāo)，對孜然超聲波輔助提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。根據(jù)表2的有關(guān)數(shù)據(jù)，對孜然提取物得率進(jìn)行統(tǒng)計分析，方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

續(xù) 表

表3 方差分析

由表3可知，相關(guān)系數(shù)R2為93.35%，回歸模型達(dá)到顯著水平(Pr=0.012252<0.05)，說明回歸模型的擬合度較好。通過SAS中RSRGE優(yōu)化，可得出模型的回歸方程為：

Y=4.513333-0.005X1-0.04875X2-0.08125X3-0.357917X12+0.26X1X2-0.075X1X3- 0.260417X22+0.1775X2X3-0.400417X32。

通過方程求解，可求出孜然提取物得率最優(yōu)工藝組合：粉碎粒徑為0.3 mm，提取時間為1.04 h，料液比為1∶12 (g/mL)。

為進(jìn)一步分析雙因素對模型的影響，將其中1個因素固定在零水平，研究另外2個因素對孜然提取物得率的影響，趨勢圖見圖4。

圖4 趨勢圖

圖4中a表示將X3固定在零水平，由圖4中a可以看出，響應(yīng)值均隨著X1和X2的增大先增大后減小；圖4中b表示將X2固定在零水平，由圖4中b可以看出，響應(yīng)值隨著X1的增大先增大后減?。挥蓤D4中c可以看出，響應(yīng)值隨著X2的增大先增大后減小，隨著X3的增大先增大后減小。由圖4分析可以得出，趨勢圖中有一穩(wěn)定點且為最大值。

根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化試驗確定的工藝，對孜然提取物得率做了3次試驗，進(jìn)行驗證，結(jié)果見表4。

表4 驗證結(jié)果

由表4可知，驗證試驗結(jié)果與響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果相符合，說明響應(yīng)面法優(yōu)化孜然提取物工藝是合理的。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 DPPH自由基清除作用

DPPH是最古老的間接測定方法，廣泛應(yīng)用于測定天然抗氧化劑的自由基清除能力[13]，DPPH為穩(wěn)定的自由基，溶于甲醇等極性溶劑中，DPPH自由基的清除是通過物質(zhì)在反應(yīng)中提供氫原子或電子來完成的。孜然提取物與BHT對DPPH自由基清除能力試驗結(jié)果見圖5。

圖5 孜然提取物與BHT對DPPH自由基清除能力

由圖5可知，隨著濃度的增加，DPPH的清除率呈逐漸增大的變化趨勢，孜然提取物對DPPH自由基清除率值都低于BHT，這種差異是由還原性物質(zhì)的還原能力和濃度造成的，這些結(jié)構(gòu)上的不同造成了抗氧化能力或其他生物活性的復(fù)雜變化。近來，研究表明孜然提取物[14]具有一定的自由基清除能力。

3.3.2 ·OH清除作用

孜然提取物與BHT對·OH清除能力試驗結(jié)果見圖6。

圖6 孜然提取物與BHT對·OH清除能力

由圖6可知，隨著樣品濃度增加，其對·OH的清除率也逐漸升高，當(dāng)濃度達(dá)10 mg/mL時，孜然提取物對·OH的清除率最高，達(dá)75.6%。

4 結(jié)論

利用孜然超聲波輔助提取工藝的優(yōu)化研究表明，孜然提取物的最佳工藝條件為：粉碎粒徑0.3 mm，提取時間1.04 h，料液比1∶12 (g/mL)，此時，孜然提取物的得率為4.51%。

孜然提取物對DPPH自由基及·OH抗氧化試驗表明，孜然提取物在濃度2～10 mg/mL范圍內(nèi)，對DPPH自由基清除率及·OH清除率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)逐漸增大的變化趨勢，濃度達(dá)10 mg/mL時，孜然提取物對·OH清除率為75.6%。