楊慶麗，董艷，劉玉，石杰，姬妍茹

(黑龍江省科學院 大慶分院，黑龍江 大慶 163319)

黑蒜是生大蒜在變溫條件下加工生產(chǎn)的一種新型健康食品，成品黑蒜顏色黑亮，口味酸甜。其顏色變化的主要原因是生成了大量的類黑精。類黑精是美拉德反應(yīng)過程中還原糖等的羧基與氨基酸等的游離氨基之間發(fā)生縮合生成一種棕褐色甚至黑色的大分子化合物[1]。研究表明：類黑精具有抗氧化、降糖、降血壓、防齲齒等功效，其抗氧化強度甚至與目前食品中常用的抗氧化劑維生素C相媲美[2]。目前普遍認為類黑精是一類具有相似荷質(zhì)比，結(jié)構(gòu)非常接近的復(fù)雜混合物[3]。如劉亞玲等[4]的研究表明：咖啡類黑精成分非常復(fù)雜，最多的為棕櫚酸和硬脂酸，其次是胺類、酯類、酚類、吡咯類、呋喃類、吡啶類、醛類、醇類、酮類等。類黑精的形成受較多因素的影響，反應(yīng)體系的底物是其中極其重要的因素[5]。因此，本研究對黑蒜加工過程中與類黑精形成相關(guān)的還原糖、總糖、氨基酸及5-HMF變化進行分析。同時采用Py-GC-MS技術(shù)分析黑蒜類黑精組成，為美拉德反應(yīng)中呈色物質(zhì)的形成機理提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生大蒜：北京華聯(lián)超市；5-羥甲基糠醛標準品(≥98%)：北京中科儀友化工技術(shù)研究院；DNS試劑：自配；其他試劑：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Master-D UF實驗室超純水機 上海和泰儀器有限公司；UV765紫外可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；Epoch酶標儀 美國BioTek公司；LC-15C高效液相色譜儀 日本島津公司；L-8900全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；ISQ LT GC-MS聯(lián)用儀 美國Thermo公司；臺式高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 糖粗提液的制備

黑蒜含糖量較高、難以烘干。因此，以下試驗中生大蒜及黑蒜重量為根據(jù)含水量折合后的干重。水分測定采用GB 5009.3-2010中的直接干燥法。

取不同加工時間點黑蒜樣品各1 g分別加入2 mL滅菌蒸餾水，浸泡3 h后充分研磨，加入滅菌蒸餾水8 mL沸水煮20 min，80 ℃，150 W超聲提取30 min，定容至10 mL，10000 r/min離心15 min后上清即為糖粗提液。

1.3.2 還原糖及總糖的測定

取糖粗提液，DNS法[6]和苯酚-硫酸法測定還原糖及總糖含量[7]，以果糖計。以等體積糖粗提液不加顯色劑直接定容至刻度為本底色，酶標儀測定前所有樣品反應(yīng)液需9000 r/min離心15 min取上清。

1.3.3 總氨基酸的測定

黑蒜總氨基酸測定參考了董愛榮等[8]的方法；取不同加工時間黑蒜樣品各100 mg研磨后加入15 mL滅菌蒸餾水，50 ℃超聲30 min，加入15 mL濃HCl，氮吹儀30 min，105 ℃水解24 h。14000 r/min離心10 min，取上清3 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后以0.02 mol/L鹽酸溶解定容至10 mL。0.22 μm水膜過濾后氨基酸分析儀上樣20 μL測總氨基酸量。

1.3.4 5-羥甲基糠醛(5-HMF)分析

5-HMF含量根據(jù)NY/T 1332-2007中樣品處理及液相條件測定[9]。色譜柱為C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇+水(15%+85%)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為室溫，進樣量為10 μL。標準曲線方程為y=7583x+4701，R2=0.997。

1.3.5 黑蒜類黑精的制備

根據(jù)類黑精易溶于水而不溶于乙醇的特性，本研究參考了嚴昊[10]的提取方法。取成品黑蒜50 g，加入150 mL滅菌蒸餾水浸泡24 h，10000 r/ min離心15 min取上清，加入2.5倍體積(V/V)的無水乙醇，10 h后棄上清，再加入約2倍體積(V/V)的無水乙醇，搖勻后二次醇沉3 h，棄上清，揮干乙醇得類黑精。

1.3.6 黑蒜類黑精Py-GC-MS分析

類黑精Py-GC-MS反應(yīng)條件參考了劉亞玲等的方法。稱取黑蒜類黑精0.5 mg，包裹于鐵磁體的熱箔片中，在450 ℃條件下裂解后進樣分析。

Py條件：熱裂解溫度450 ℃，熱裂解時間10 s。

GC條件： J & W DB-5石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；分析采用一級程序升溫，初始溫度60 ℃，保持5 min，以30 ℃/min的速度升至270 ℃，保持5 min；載氣為氦氣；流量為25 mL/min。

MS條件：電子電離源；傳輸線溫度 270 ℃；離子源溫度220 ℃；掃描時間0.2 s；質(zhì)量掃描范圍50～400 m/z。面積歸一化法確定主要裂解產(chǎn)物的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007及Graphpad Prism 5進行作圖及差異顯著性分析。p<0.05為差異顯著，p>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑蒜加工中顏色變化

圖1 黑蒜加工中顏色變化Fig.1 Color changes of black garlic during processing

由圖1可知，隨著加工進行，黑蒜顏色逐漸加深，由1 h的乳白色變?yōu)?60 h的黑色。圖1中各加工時間點含水量分別為64.56%，63.66%，63.62%，68.54%，61.87%，57.62%，61.11%，48.32%，40.04%，38.49%，40.04%，37.63%。

2.2 還原糖及總糖含量

大蒜中糖含量豐富，主要是果糖、葡萄糖和半乳糖[11]，這些糖能夠為黑蒜類黑精的生成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 不同加工時間還原糖及總糖含量分析(干重)Fig.2 Analysis of reducing sugar and total sugar at different processing time (dry weight)

由圖2可知，黑蒜加工過程中總糖含量在0，360 h分別為444.85，351.52 mg/g，整體呈下降趨勢；其中0～24 h趨于穩(wěn)定(p>0.05)；12，24，72，120 h分別為481.79，466.18，397.09，371.88 mg/g，顯著下降(p<0.05)；之后保持穩(wěn)定(p>0.05)。有研究表明，美拉德反應(yīng)中，果糖能夠與氨基酸反應(yīng)生成焦糖香物質(zhì)[12]。因此，總糖含量降低可能與黑蒜加工中果糖等參與美拉德反應(yīng)生成了類黑精有關(guān)。還原糖含量變化總體趨勢為先上升后穩(wěn)定；其中0～24 h含量無顯著變化(p>0.05)；24，72，120，168 h分別為23.80，42.36，48.78，62.28 mg/g，顯著升高(p<0.05)；之后趨于穩(wěn)定(p>0.05)；360 h顯著高于0 h(p<0.05)。由以上結(jié)果可知12，24，72，120，168 h是糖變化的關(guān)鍵點，這些節(jié)點應(yīng)該與黑蒜口味生成相關(guān)。

2.3 氨基酸組成及含量

表1 不同加工時間總氨基酸含量分析(干重)Table 1 Analysis of total amino acid content at different processing time (dry weight)

注：*為必需氨基酸。

由表1可知，黑蒜中共檢測出13種氨基酸，其中4種為必需氨基酸，除組氨酸基本無變化外(p>0.05)，其他氨基酸在整個加工過程中均呈逐漸降低趨勢。原因是氨基酸合成類黑精的同時加熱分解生成了呋喃和吡啶等物質(zhì)。其中降幅最大的為精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸(p<0.05)，分別為97.5%，85.1%，75.4%，75.1%，這幾種氨基酸為參與美拉德反應(yīng)的主要氨基酸。很多研究中以賴氨酸、精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸為基礎(chǔ)建立美拉德反應(yīng)模型[13,14]。秦禮康等[15]的研究表明，形成類黑精的主要氨基酸殘基是天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和脯氨酸。由此可知，參與美拉德反應(yīng)從而生成類黑精等呈香、呈色物質(zhì)，可能是黑蒜加工中大多數(shù)氨基酸含量降低的主要原因。

2.4 5-HMF含量分析

5-HMF是類黑精形成的中間產(chǎn)物，食品加工中，美拉德反應(yīng)以及糖類的受熱分解都會大量產(chǎn)生[16]。大蒜中糖含量豐富能夠為5-HMF的生成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖3 5-HMF含量變化(干重)Fig.3 Changes of 5-HMF content (dry weight)

由圖3可知，黑蒜加工過程中，5-HMF含量整體呈先升后降的趨勢。其中0～72 h含量基本穩(wěn)定；72～216 h含量顯著升高(p<0.05)，分別為1.89,3.21,4.62,5.40 mg/g，之后穩(wěn)中有降，360 h時為4.41 mg/g。這是由于隨著加工進行5-HMF作為類黑精的中間產(chǎn)物，逐漸消耗生成了終產(chǎn)物類黑精。目前對于5-HMF的安全性仍存在爭議。有研究認為，5-HMF能夠造成DNA損傷[17]；有些人則認為5-HMF沒有嚴重的健康危害，研究表明：通過各種動物實驗證明5-HMF有足夠大的安全限度，每天攝入量在80～100 mg/kg體重范圍內(nèi)無不利影響[18]。有報道稱5-HMF具有抗氧化、改善血液流變學等對人體有益的生物活性[19]。另外，研究發(fā)現(xiàn)黑蒜中5-HMF臍靜脈內(nèi)皮細胞有抗炎癥的作用[20]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，以5-HMF為有效成分的心血管藥物已申請相關(guān)專利[21]。因此，5-HMF的相關(guān)研究仍需繼續(xù)深入進行。

2.5 黑蒜類黑精Py-GC-MS分析

黑蒜提取類黑精，通過Py-GC-MS分析，在450 ℃裂解溫度條件下得到總離子流圖，見圖4。

圖4 黑蒜類黑精裂解總離子流圖Fig.4 Total ion current chromatograms of black garlic melanoidins

黑蒜類黑精熱裂解產(chǎn)物見表2。

表2 黑蒜類黑精熱裂解產(chǎn)物(>60.0%)Table 2 Pyrolysis products of black garlic melanoidins(>60.0%)

黑蒜類黑精裂解產(chǎn)物共115種，匹配度大于60%的27種，其中呋喃類11種，相對含量為46.08%；噻吩類3種，相對含量為2.42%；烷烴1種，相對含量為2.26%；吡咯類4種，相對含量為1.81%；酚類2種，相對含量為0.51%。

呋喃、吡咯及其衍生物，在大多數(shù)熱加工食品中普遍存在。被認為是美拉德反應(yīng)的特征產(chǎn)物，共同影響著熱加工食品的風味[22]。還原糖在偏酸環(huán)境下會脫羥基環(huán)化生成如糠醛、糠醇、乙?；秽?、甲基呋喃等呋喃類產(chǎn)物[23]。黑蒜類黑精中含量最高的呋喃類是3-甲基呋喃、2，5-二甲基呋喃和5-羥甲基糠醛，相對含量分別為26.82%,14.59%,1.42%，黑蒜加工中還原糖含量逐漸降低，與類黑精中呋喃相對含量較高是相符的。吡咯類相對含量分別為吡咯1.03%、1-氫-3-甲基吡咯0.11%、2-乙?；量?.26%；噻吩是肉類及植物油中常見的揮發(fā)性風味物質(zhì)[24]，黑蒜加工中，大蒜中硫醚化合物的不穩(wěn)定鍵受到高溫加熱而斷裂形成噻吩，噻吩賦予黑蒜香甜味[25]。黑精中噻吩、四氫噻吩和2-羰基三氫噻吩相對含量分別為2.01%,0.31%，0.10%。黑蒜類黑精其他組成物質(zhì)包括酸類、酯類、胺類、酚類等，但相對含量都較低，在1.0%以下。

3 結(jié)論

還原糖、總糖、氨基酸和5-HMF是與類黑精形成直接相關(guān)的幾種物質(zhì)。隨黑蒜加工的深入，各成分含量總糖降低后穩(wěn)定、還原糖升高后穩(wěn)定、氨基酸降低后穩(wěn)定、5-HMF先升后降。類黑精成分分析中，相對含量最高的是呋喃類，其中最高的為烷基呋喃(41.39%)，其次為噻吩、烷烴、吡咯等。產(chǎn)生以上變化趨勢的主要原因是美拉德反應(yīng)中，糖加熱分解以及糖和氨基酸反應(yīng)均可生成5-HMF，之后5-HMF進一步轉(zhuǎn)化生成烷基呋喃；還原糖脫羥基環(huán)化也可生成烷基呋喃。其他吡咯、噻吩等生成也與糖直接相關(guān)。這些物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化，是黑蒜的顏色與口感完全不同于生大蒜的重要原因。